夏朝霞

改良骨髓脫鈣液對免疫組化染色結(jié)果的影響

夏朝霞

目的探討酸脫鈣液對骨髓活檢組織免疫組化染色的影響。方法對445例骨髓活檢組織經(jīng)混合酸脫鈣及EDTA雙重脫鈣固定、免疫組化染色。結(jié)果組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)清晰完整，免疫組化染色定位準(zhǔn)確、背景清晰。結(jié)論混合脫鈣液與EDTA聯(lián)合應(yīng)用有助于免疫組化染色，是骨髓活檢病理診斷的有效方法。

骨髓；脫鈣；脫鈣液；免疫組織化學(xué)

骨髓活檢（BMB）技術(shù)在骨髓制片診斷中越來越具有優(yōu)越性，但骨髓組織含有大量礦化物質(zhì)，給制片造成很大難度，而且骨髓本是各種細(xì)胞的發(fā)源地，細(xì)胞種類和形態(tài)極為豐富僅有常規(guī)制片診斷難度極大，因而必須結(jié)合免疫組化染

色以利于準(zhǔn)確診斷。而傳統(tǒng)脫鈣液在脫鈣的同時往往造成組織細(xì)胞形態(tài)改變及免疫抗原的破壞、丟失影響免疫組化結(jié)果[1]。故而筆者結(jié)合骨髓組織學(xué)特點(diǎn)調(diào)整脫鈣液配方及方法，以改善制片質(zhì)量及免疫表型的表達(dá)。報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料選取寧波病理中心2011年7月至2013年4月骨髓活檢標(biāo)本445例。1.2試劑（1）脫鈣液A：4%～5%甲酸20ml；4%甲醛40ml；冰乙酸5ml；1%濃鹽酸15 ml；氧化鋁6 g，加0.9%氯化鈉注射液至400 ml。（2）脫鈣固定液B：pH 8.0的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液用1molHCL調(diào)至pH 7.2，再加入4%甲醛15 ml。（3）免疫組化試劑：一抗及二抗均購自DAKO公司。

1.3 方法（1）組織脫鈣：組織至脫鈣液A中3h，沖洗1h后在進(jìn)入脫鈣固定液B 中2h。取出后與常規(guī)小組織一起脫水、透明、浸蠟，常規(guī)包埋。（2）免疫組化染色：①切片脫蠟至水。②按抗體需要修復(fù)（酶消化或熱修復(fù)），PBS沖洗2 min×3。③3% H2O2室溫孵育15～20 min，PBS沖洗2 min×3。④滴加一抗37℃孵育60 min，PBS沖洗2min×3。⑤滴加二抗37℃孵育15 min，PBS沖洗2 min×3。⑥D(zhuǎn)AB鏡下顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片。

2 結(jié)果

骨髓組織脫鈣效果良好，組織學(xué)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞輪廓清晰完整。切片免疫組化染色定位準(zhǔn)確，染色背景清晰，無非特異性著色。見封四彩圖3～4。

3 討論

BMB在骨髓增生性腫瘤（MPN）中的原發(fā)性骨髓纖維化、原發(fā)性血小板增多癥、慢性嗜酸粒細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病急性變、肥大細(xì)胞增生癥及骨髓轉(zhuǎn)移瘤等的診斷與鑒別診斷中尤其具有獨(dú)到的優(yōu)勢，平均符合率約為94%[1]。而BMB免疫組化輔助診斷使得骨髓病理診斷及臨床預(yù)后更具積極意義。但骨髓酸脫鈣處理或多或少地降低了組織免疫組化染色的敏感性[2]。如何使脫鈣液既能有效脫鈣制片又最大程度的保留抗原的完整性，利于免疫組化染色是骨髓制片技術(shù)的研究方向。

脫鈣的目的是脫去骨基質(zhì)中的羥基磷灰石（HAP）同時不破壞組織細(xì)胞形態(tài)，不損傷細(xì)胞大分子物質(zhì)丟失抗原。傳統(tǒng)脫鈣液如硝酸，屬強(qiáng)酸在脫鈣過程中產(chǎn)生二氧化碳?xì)馀菘梢鸾M織變形，而且組織酸化易使HE染色時細(xì)胞核染色欠佳[3]。本方法選用混合酸配方及EDTA甲醛液雙重脫鈣、雙重固定。從而在短時間內(nèi)使組織脫鈣完全快速、組織固定充分、抗原保存良好。本文中的脫鈣液A為復(fù)合脫鈣液：4%～5%甲酸（CH2O2）為有機(jī)酸又稱蟻酸為一種弱酸。因其性能相對溫和，作用緩慢適用于免疫組化染色[4]。濃鹽酸（CHL）是一種強(qiáng)酸為無機(jī)酸，具極強(qiáng)揮發(fā)性。可加速脫鈣，但可使組織略收縮，影響核染色。但有報道顯示1%鹽酸短時間浸泡對組織細(xì)胞形態(tài)和大部分抗原免疫組化染色效果影響不大，背景染色較少[2]。故本文中選用1%鹽酸，減少組織收縮和對染色的影響。4%甲醛（HCHO）為強(qiáng)還原劑，是一種良好的固定劑，在微堿性時還原性更強(qiáng)。0.9%氯化鈉為等滲溶液，pH為中性。加入0.9%氯化鈉不僅可以平衡酸溶液，而且能起到水化甲酸、甲醛的作用，使溶液更具親水性，滲透性更強(qiáng)。而HAP屬極性分子具有親水性，被水化的甲酸、甲醛能更好地與HAP反應(yīng)。

EDTA有機(jī)鹽類為重要的絡(luò)合劑，而且EDTA可消除微量金屬導(dǎo)致的酶催化反應(yīng)中的抑制作用，在蛋白質(zhì)工程及試驗(yàn)中可在不影響蛋白質(zhì)功能的情況下去除干擾離子。故而EDTA為一種理想的利于免疫組化染色的脫鈣液[5]。但EDTA性質(zhì)溫和，對組織滲透性差，脫鈣時間過長影響診斷及治療[6]。本文使用EDTA再次脫鈣固定，既進(jìn)一步完善脫鈣固定，減少組織固定不佳抗原破壞和丟失，而造成抗原移位，抗體特異性差，濃度不夠或嚴(yán)重交叉反應(yīng)[7]。又可減少酸對組織的損傷，最大程度的避免由此造成的假陽性或假陰性表達(dá)。減少人為因素的干擾才能獲得理想的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，最準(zhǔn)確的病理診斷。

[1]陳樹輝.骨髓病理學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2010:2-39.

[2]杜鵑,柳劍英,蘇靜.兩種組織脫鈣法對免疫組織化學(xué)染色影響比較[J].北京大學(xué)學(xué)報,2011,143(2):290-294.

[3]謝玲,鄒麗宜,張志平,等.改良脫鈣液制作脫鈣骨石蠟切片與傳統(tǒng)方法的比較[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(11): 2125-2128.

[4]JohnD,Bancroft ManlynGamble.組織學(xué)技術(shù)的理論與實(shí)踐[M].北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2010:285-312.

[5]蘭淼,鞏麗,李艷紅,等.不同脫鈣液對骨髓組織切片HE染色效果的對比研究[J].陜西醫(yī)學(xué),2010,39(10):1299-1301.

[6]謝燕,龔曉楠,陳紅.Rapidcal Immuno在骨髓脫鈣中的應(yīng)用[J].診斷病理學(xué)雜志, 2012,29(5):399.

[7]紀(jì)小龍,張雷.診斷免疫組織化學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社.2011:26-38.

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.08.047

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