馬能強，陳琦，李勇，龔晟

Calretinin基因在先天性巨結(jié)腸腸壁中的表達及意義

馬能強，陳琦，李勇，龔晟

目的分析Calretinin（CR）基因在先天性巨結(jié)腸（HD）中的表達情況，探討其在HD中的意義。方法采用RTPCR技術(shù)檢測18例對照組患兒結(jié)腸和HD患兒痙攣段、擴張段結(jié)腸腸壁中CR基因的表達，計算其相對量并進行比較分析。結(jié)果HD痙攣段和HD擴張段CR基因表達的相對量分別為0.14±0.10和0.57±0.09，對照組為0.82±0.09；3 組CR基因表達的相對系數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01），3組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（均＜0.01）。結(jié)論CR基因在HD患兒腸管中表達水平下調(diào)可能與散發(fā)性HD的發(fā)生關(guān)系密切，其可能參與了HD的發(fā)生。

兒童；先天性巨結(jié)腸；Calretinin基因

鈣離子（Ca2+）是細胞內(nèi)重要的第二信使，它參與一系列神經(jīng)細胞生理活動，對神經(jīng)細胞的代謝和功能產(chǎn)生廣泛的影響。細胞內(nèi)自由Ca2+濃度的維持對細胞來說非常重要，Ca2+的維持靠各種鈣泵和鈣結(jié)合蛋白（CaBP），鈣結(jié)合蛋白在此過程中發(fā)揮重要的介導調(diào)節(jié)作用。鈣視網(wǎng)膜蛋白（CR）是其中較重要的一種，關(guān)于CR基因生物化學及細胞生物學的研究報道較少，是否與先天性巨結(jié)腸（HD）的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，其具體功能怎樣，通過什么途徑如何對HD的發(fā)生、發(fā)展進行調(diào)節(jié)，目前尚不甚清楚。國外有研究發(fā)現(xiàn)在HD患者無神經(jīng)節(jié)細胞腸段CR缺失[1]，認為CR基因與HD的發(fā)病有關(guān)。筆者觀察CR基因在HD患兒結(jié)腸腸壁中表達情況，旨在探討HD的發(fā)生機制。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集鄭州大學第三附屬醫(yī)院2007年4月至2012年6月間經(jīng)臨床確診的、并術(shù)后病理切片證實的散發(fā)性HD腸管組織標本18份（患兒18例）作為實驗組，其中男14例，女4例；年齡0.5～49個月，平均（5.3±1.1）個月；長段型2例，常見型8例，短段型8例。HD術(shù)前診斷依病史、體征、鋇劑灌腸造影檢查、直腸黏膜活檢綜合判斷確診，鋇劑灌腸顯示痙攣段及其上的擴張段，直腸黏膜活檢HE染色顯示痙攣段缺乏神經(jīng)節(jié)細胞。術(shù)后經(jīng)有經(jīng)驗病理科醫(yī)師二次證實痙攣段無神經(jīng)節(jié)細胞。對照組選取年齡相似的非HD患兒，如腸套疊、美克耳憩室、結(jié)腸穿孔等18例手術(shù)切除之結(jié)腸標本作對照組，患兒均無合并HD，家族中也沒也沒有HD家族史。對照組18例，其中男12例，女6例；年齡2～62個月，平均（8.5±1.7）個月。實驗組和對照組間性別和年齡差異均無統(tǒng)計學意義（均＞0.05）。

1.2 主要試劑AMV一步法RT-PCR試劑盒購自上海生物工程技術(shù)服務有限公司，DNAmaker由寶生物工程（大連）有限公司提供，Trizol總RNA提取試劑為美國invitrogen公司產(chǎn)品。引物由GenBank查知CR基因全序列，由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司合成部設計并合成CR基因和-actin基因引物序列。引物序列見表1。余試劑均由鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理實驗室提供，本實驗亦在上實驗室完成。

1.3 方法

1.3.1 病例標本的處理和保存手術(shù)中分別取HD患兒痙攣段（實驗痙攣組）、擴張段（實驗擴張組）近端以及對照組患兒新鮮結(jié)腸標本，0.9%氯化鈉注射液沖洗后去掉黏膜層和漿膜層的纖維組織，放入標記好的經(jīng)DEPC處理過的凍存管中，立即用便攜式液氮罐運至實驗室，置－86℃低溫冰箱保存，待所有標本收集后一起檢測。

1.3.2 RT-PCR檢測3組標本中各結(jié)腸腸壁中CR mRNA情況

1.3.2.1 組織總RNA的提取擴增先按試劑盒說明提取組織內(nèi)總RNA并行純度鑒定：用DEPC水將提取的總RNA稀釋1000倍，紫外分光光度儀測260 nm 和280 nm波長的吸光度，即OD260和OD280，測得OD260/OD280在1.8～2.0。表示提取的RNA純度高，蛋白質(zhì)污染少，所得RNA可以用來逆轉(zhuǎn)錄和擴增。然后按RT-PCR試劑盒提供的反應條件逐步加入試劑。

1.3.2.2 瓊脂糖凝膠電泳和圖像分析取擴增產(chǎn)物或DNA maker 5ul、6×加樣緩沖液1 l、溴酚蘭1l充分混勻，加入1%瓊脂糖凝膠上樣孔中電泳20～30min。凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照、行灰度掃描，出現(xiàn)明亮的特異條帶者，收集保存于－20℃冰箱。應用圖像分析軟件作半定量分析，以CR/-actin灰度值之比表示CR表達的相對量，以減少誤差。

1.4 統(tǒng)計方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，3組間比較采用檢驗，兩兩比較采用LSD-檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)參-actin在各段結(jié)腸壁中的表達情況內(nèi)參-actin產(chǎn)物大小為385bp，DNAmaker單位為100 bp，電泳結(jié)果顯示，在各段腸壁中-actin均穩(wěn)定表達，條帶清晰（封三彩圖6）。

2.2 對照組和散發(fā)性HD患兒各段結(jié)腸腸壁中CR基因mRNA的表達情況CR基因mRNART-PCR產(chǎn)物為231 bp，其電泳結(jié)果示，與正常對照組相比，HD

擴張段、HD痙攣段CR基因mRNA的相對量逐漸減少，在HD痙攣段未見明顯表達。3組CR基因表達的相對系數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義（=37.16，＜0.01），3組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（均＜0.01）。見表2和封三彩圖7。

3 討論

HD最基本的病理特點是病變腸管的肌間神經(jīng)叢及黏膜下神經(jīng)叢中神經(jīng)節(jié)細胞缺如，以及異常增生的神經(jīng)纖維，累及范圍從腸管某段開始直到直腸肛門。其病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，目前認為，HD發(fā)病是多個基因或易感位點共同作用或相互交叉影響的結(jié)果，其中RET/GDNF以及EDN-3/EDNRB/ECE-1這兩個信號通路的研究最為廣泛，任何一個信息通路傳導障礙均會引起患兒胚胎期神經(jīng)嵴細胞的移行、發(fā)育、分化異常，發(fā)生神經(jīng)節(jié)細胞的缺失，導致HD的發(fā)生。RET、EDNRB、EDN3基因作為以上兩個通路系統(tǒng)的核心基因，是目前研究HD發(fā)病機制的重點。RET基因信號通路障礙主要引起家族性巨結(jié)腸，RET突變能解釋50%的家族性HD，但只能解釋15%～20%的散發(fā)性HD[2]，而EDN-3基因信號通路系統(tǒng)異常主要表現(xiàn)在散發(fā)性HD。和RET基因突變不一樣，EDN-3或EDNRB基因的變異在長段型HD中并不常見。EDNRB基因剔除試驗制成的鼠，其消化道的結(jié)構(gòu)大體正常，結(jié)腸的損害是短段腸壁內(nèi)無神經(jīng)節(jié)細胞，而不是全部結(jié)腸，所以說EDN-3通路系統(tǒng)的異常更加接近于臨床上的HD。當EDN-3與EDNRB受體蛋白結(jié)合后，可將細胞外的信號級聯(lián)性放大并傳入細胞內(nèi)，引起細胞內(nèi)鈣離子濃度的改變，并激活腺苷酸環(huán)化酶，對腸神經(jīng)節(jié)細胞的發(fā)育具有重要作用[3]。CR是一種鈣結(jié)合蛋白，最近發(fā)現(xiàn)在腸神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，主要作用是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+濃度，防止細胞內(nèi)自由Ca2+的急驟增高引起的神經(jīng)細胞興奮性中毒損傷[4-5]，具有神經(jīng)保護作用。2004年Barshack等[1]研究10例HD患者的直腸乙狀結(jié)腸全厚切片（共54個固體石蠟），發(fā)現(xiàn)在HD患者無神經(jīng)節(jié)細胞腸段CR表達缺失，認為CR基因的變異或表達異常與HD的發(fā)病有關(guān)聯(lián)。2009 年Kapur等[6]研究14例HD患者和17例對照組直腸活檢，發(fā)現(xiàn)CR免疫組化反應比直腸乙酰膽堿脂酶組織化學檢查在診斷HD上更能減少誤診率。

本文研究18例對照組和18例散發(fā)性HD患兒各段結(jié)腸腸壁中CR基因mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)在散發(fā)性HD患兒結(jié)腸標本中，不論是有神經(jīng)節(jié)細胞段還是無神經(jīng)節(jié)細胞段，CR基因mRNA的平均相對系數(shù)均少于對照組，在HD痙攣段尤其明顯；這說明，CR的表達的降低或缺失可能參與散發(fā)性HD的發(fā)生，其可能機制是：（1）CR的減少或缺失使神經(jīng)細胞胞內(nèi)瞬間Ca2+緩沖能力下降，導致神經(jīng)細胞受損發(fā)生凋亡所致。（2）CR可能參與RET/GDNF以及EDN-3/EDNRB/ECE-1這兩個信號通路的調(diào)節(jié)。Kjaer等[7]研究證明，RET胞外鈣粘蛋白結(jié)合域可直接與Ca2+結(jié)合，RET配基復合體的形成必須有Ca2+的參與，細胞外Ca2+缺乏使RET加工和插入質(zhì)膜的過程受阻；McCallion等[3]研究顯示當EDN-3與其跨膜蛋白配體EDNRB結(jié)合后，可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度，引起細胞的收縮和分泌。（3）CR還可通過調(diào)節(jié)基因表達影響其他HD發(fā)生的相關(guān)因子，CR不僅存在于細胞質(zhì)中，且部分存在細胞核內(nèi)，核內(nèi)CR還可作為鈣信使調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[8-9]。如：神經(jīng)膜上Ca2+通道開放使胞漿中游離的Ca2+濃度迅速升高，刺激誘導c-fos基因異常表達。有研究發(fā)現(xiàn)c-fos基因參與神經(jīng)細胞的生長、分化和信息傳遞等生理過程，與神經(jīng)細胞的功能和結(jié)構(gòu)損害有著密切關(guān)系[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，C-fos基因過度表達可促進HD神經(jīng)節(jié)細胞的損害，導致HD的發(fā)生[11]。綜上，可以認為CR可能通過共同調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度，從而影響腸道神經(jīng)嵴細胞的分化、發(fā)育、成熟及定居，在HD發(fā)病中起到一定的作用。

表1 CR和-actin引物序列特征

表2 各段結(jié)腸腸壁中CR基因表達的平均相對量

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.08.044

R725.7

A

1671-0800(2014)08-0997-03

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