朱磊李君董海榮王春民

頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司河北省中藥新輔料工程技術(shù)研究中心，河北承德067000

黃芩莖葉提取物純化方法優(yōu)選

朱磊李君董海榮王春民

頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司河北省中藥新輔料工程技術(shù)研究中心，河北承德067000

目的優(yōu)選黃芩莖葉提取物的純化方法，為黃芩莖葉總黃酮的分離純化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法以黃芩莖葉總黃酮的轉(zhuǎn)移率、純度作為考察指標(biāo)，采用酸沉法、酸堿法、堿溶酸沉、重結(jié)晶法4種方法分別對(duì)黃芩莖葉總黃酮進(jìn)行純化，優(yōu)化純化條件，并對(duì)純化結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果4種方法制備的總黃酮的轉(zhuǎn)移率依次為：64%、59%、54%、62%，總黃酮純度依次為：48%、78%、69%、47%。結(jié)論通過(guò)對(duì)4種純化方法進(jìn)行比較可得，酸堿法能提高黃芩莖葉的純化效果，該研究可以為黃芩莖葉生產(chǎn)中制訂合理的純化方法提供試驗(yàn)依據(jù)，對(duì)生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

黃芩莖葉；紫外分光光度法；純化工藝；正交試驗(yàn)

黃芩為我國(guó)華北道地藥材之一，為唇形科植物黃芩，又名山茶根、土金茶根。黃芩收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》、《滇南本草》、《本草正》等，是現(xiàn)代中國(guó)藥典收載的常用中藥。黃芩屬于半野生半家種品種，該品種年銷量近萬(wàn)噸，為四十種大宗藥材品種之一。野生主要分布我國(guó)河北、山西北部，內(nèi)蒙中東部和東北三省大部，河北承德，內(nèi)蒙古赤峰等幾個(gè)最具規(guī)模的主產(chǎn)區(qū)，是我國(guó)北方野生中藥材的主要品種之一[1]。黃芩多數(shù)以根入藥。而莖葉大多棄之不用。黃芩莖葉的主要化學(xué)成分包括野黃芩苷、黃芩苷、白楊素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷等黃酮類化合物[2]。何春年等[3]研究發(fā)現(xiàn)，臨床所用的黃芩根中主要含有以黃芩總黃酮為主的黃酮類活性成分，而其莖葉也含有黃酮類等有效活性成分。黃芩莖葉具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、保護(hù)心肌缺血、降血壓、降血糖等藥理作用[4-9]。為了更有效地利用中藥資源，人們對(duì)黃芩莖葉進(jìn)行提取純化研究試驗(yàn)，已達(dá)到制備高純度的總黃酮，以滿足制劑研究的需要。近年來(lái)，研究有關(guān)黃芩莖葉總黃酮提取、純化的方法主要有以酸沉法為主，但純化方式略有不同，黃芩莖葉總黃酮純化工藝做了一定的研究，但純化方法之間沒(méi)有進(jìn)行比較，哪個(gè)純化方法更好，結(jié)果難以定論。因此，筆者在已有的研究基礎(chǔ)上，對(duì)黃芩莖葉總黃酮的純化工藝做了系統(tǒng)的考察和比較。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AL204電子天平（梅特勒-托利多）；KQ-700DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DK-98-1水浴鍋（天津市中環(huán)試驗(yàn)電爐有限公司）；TDL-40B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；FW80型粉碎機(jī)（天津市斯泰特儀器有限公司）；，RE-5286A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司）；UV-2401PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2試藥

黃芩莖葉藥材（頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司中藥種植園采摘，經(jīng)頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司高級(jí)工程師張雪榮鑒定為是唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥地上部分）；野黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110842-201206）；水為二次蒸餾水，甲醇（色譜純），其余試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩莖葉的提取

稱取黃芩莖葉藥材1000 g，粉碎成粗粉。用60%乙醇提取3次。每次8倍量，提取時(shí)間2 h，提取后過(guò)濾，合并濾液，濃縮至乙醇無(wú)醇味，將浸膏平均分為4份[10-12]，備用。

2.2 黃芩莖葉的純化方法比較

2.2.1 酸沉法取上述待純化樣品溶液1份，加濃鹽酸調(diào)pH 3.0～4.0，靜置后濾去雜質(zhì)，在40℃調(diào)pH至2.0，保溫，靜置2 h，過(guò)濾，沉淀用水洗至pH為中性，干燥，即得。并用紫外分光光度法測(cè)固體物中的總黃酮含量[13]。

2.2.2 酸堿法取上述待純化樣品溶液1份，加濃鹽酸調(diào)pH 1.0，放置15 h。離心，取沉淀物進(jìn)行干燥，加水，70℃水浴加熱，10%NaOH溶液調(diào)至pH 6.0。加入45%乙醇，放置1 h，抽濾，沉淀用45%乙醇洗滌，濾液加濃鹽酸調(diào)到pH 1.0，70℃下保溫1 h，放置10 h，抽濾，所得沉淀干燥，即得。并用紫外分光光度法測(cè)固體物中的總黃酮含量[14]。

2.2.3 堿溶酸沉法取上述待純化樣品溶液1份，加入10%氫氧化鈉溶液，調(diào)pH至7.5。趁熱濾過(guò)，濾液加熱，緩緩加入20%硫酸溶液，調(diào)pH值至2.0，在60℃保溫18 min，靜置0.5 h，析出棕色沉淀物，傾取上層液，靜置20 h后，析出棕黃色沉淀物，分取棕色沉淀物和棕黃色沉淀物，低溫干燥，即得。并用紫外分光光度法測(cè)固體物中的總黃酮含量[15]。

2.2.4 重結(jié)晶法取上述待純化樣品溶液1份，加濃鹽酸調(diào)pH 2.0，55℃保溫6 h，濾過(guò)，重結(jié)晶，真空干燥，即得。并用紫外分光光度法測(cè)固體物中的總黃酮含量。

2.3 黃芩莖葉樣品測(cè)定結(jié)果

以轉(zhuǎn)移率和純度為考察指標(biāo)，分別采用酸沉法、酸堿法、堿溶酸沉、重結(jié)晶法四種方法，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芩莖葉純化方法的比較（%）

由表1可以得出酸堿法的轉(zhuǎn)移率和純度比較高，所以筆者選擇酸堿法并對(duì)之進(jìn)行優(yōu)選試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表2 因素水平設(shè)計(jì)

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果表

表4 方差分析表

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察了因素A（堿調(diào)pH值）、因素B（活性炭加入量）、因素C（保溫溫度）、因素D（保溫時(shí)間）4個(gè)因素，以黃芩莖葉總黃酮為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按正交試驗(yàn)L9（34）表設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化最佳工藝組成和用量，結(jié)果見(jiàn)表3。其中極差砸反映各因素對(duì)指標(biāo)影響的程度，極差砸越大，影響程度越大，本試驗(yàn)4個(gè)因素砸值排列為A＞B＞C＞D，但各因素對(duì)純化黃芩莖葉總黃酮的影響均不明顯（P＞0.05）。由表3數(shù)據(jù)可知，堿調(diào)pH值用量是影響黃芩莖葉總黃酮提取物的主要因素。各因素水平分析結(jié)果為A：2＞3＞1；B：3＞2＞1；C：3＞2＞1；D：3＞2＞1，所以本研究選擇A2B3C3D3。

2.4 純化工藝驗(yàn)證

稱黃芩莖葉藥材2000 g，粉碎成粗粉。用60%乙醇提取3次。每次8倍量，提取時(shí)間2 h，提取后過(guò)濾，合并濾液，濃縮至乙醇無(wú)醇味，將浸膏加濃鹽酸調(diào)pH 1.0，放置12 h。離心，取沉淀物進(jìn)行干燥，加水，70℃水浴加熱，10%NaOH溶液調(diào)至pH 7.0。加入45%乙醇，放置1 h，抽濾，沉淀用45%乙醇洗滌，濾液加濃鹽酸調(diào)到pH 1.0，80℃下保溫1.5 h，放置10 h，抽濾，所得沉淀干燥，即得。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 黃芩莖葉提取物純化結(jié)果（%）

2.5 樣品含量測(cè)定

2.5.1 野黃芩苷對(duì)照品溶液的制備精密稱野黃芩苷對(duì)照品4.25 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲使之完全溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，制成濃度為0.17 mg/mL的對(duì)照液，作為對(duì)照品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備取純化后的黃芩莖葉提取物研細(xì)，精密稱取10 mg于100 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲20 min，待冷卻后用甲醇稀釋至刻度，搖勻，吸取2 mL至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.5.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取對(duì)照品對(duì)照液和供試品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法（《中國(guó)藥典》2010年版）在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示，二者均在285 nm處有最大吸收，因此選擇285 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取上述野黃芩苷對(duì)照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到系列對(duì)照品溶液。以甲醇為空白，采用紫外分光光度法在285 nm下測(cè)定吸收度，以吸收度A為縱坐標(biāo)，溶液濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到線性回歸方程，得回歸方程為A=49.172C-0.0075，r=0.9997，結(jié)果顯示野黃芩苷在0.0064～0.0323 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗(yàn)精密量取上述野黃芩苷對(duì)照品溶液，在285 nm處，以甲醇為空白，按照測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)測(cè)定6次吸光度，結(jié)果對(duì)照品溶液的平均吸收度值為0.2996，RSD值為0.52%，精密度較好。

2.5.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)取本品100 mg，研細(xì)，精密稱取9份，分為3組，每組分別為8、10、12 mg，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液；另取對(duì)照品溶液，按上述測(cè)定方法分別測(cè)定野黃芩苷的吸收度，記錄吸收度值，計(jì)算樣品含量。樣品平均含量為70.6%，RSD值為1.3%。重現(xiàn)性良好。

2.5.7 穩(wěn)定性考察取同一批號(hào)的供試品溶液，分別在放置0、2、4、6、8 h后，測(cè)定其吸收度。結(jié)果表明，樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD值為0.876%。

2.5.8 回收率試驗(yàn)取本品100 mg，研細(xì)，精密稱取9份，每份約5 mg，精密加入不同量的野黃芩苷對(duì)照品溶液，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，按上述測(cè)定方法測(cè)定各樣品的吸收度，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 野黃芩苷含量測(cè)定加樣回收率試驗(yàn)

3 討論

縱觀我國(guó)中藥資源的開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀，一方面資源不足，一些蘊(yùn)藏豐富的資源尚未得到合理開(kāi)發(fā)和利用；另一方面，又存在著嚴(yán)重的浪費(fèi)和破壞，嚴(yán)重制約了中醫(yī)藥事業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。如何合理開(kāi)發(fā)利用有限的中藥資源，減少中藥資源的浪費(fèi)，關(guān)系到中藥能否更好地為人類健康服務(wù)。藥用植物不同部位的開(kāi)發(fā)利用是合理利用有限的中藥資源的有效途徑之一。中藥商品藥材按照傳統(tǒng)，僅以某些特定部位入藥，其余多廢棄不用。事實(shí)證明被棄部位或含有與入藥部位相同的有效成分或有其他藥效或用途。黃芩傳統(tǒng)上以根部入藥，而產(chǎn)量為根部數(shù)倍的莖葉則棄之不用，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)黃芩莖葉的主要成分為黃酮類化合物，確定黃芩莖葉黃酮的主要成分為野黃芩苷，并且與黃芩根所含成分（主要成分為黃芩苷）有明顯差異。

本試驗(yàn)研究了酸沉法、酸堿法、堿溶酸沉、重結(jié)晶法4種方法分別對(duì)黃芩莖葉總黃酮進(jìn)行純化。得出酸堿法在轉(zhuǎn)移率以及黃芩莖葉總黃酮純度上均高于其他3種純化方法。在此基礎(chǔ)上利用正交實(shí)驗(yàn)得到黃芩莖葉提取物純化工藝的優(yōu)化條件，并摸索了比較完整的適合工業(yè)化生產(chǎn)的黃芩莖葉總黃酮提取物工藝條件。最佳工藝為稱黃芩莖葉藥材粉碎成粗粉。用60%乙醇提取3次，每次8倍量，提取時(shí)間2 h，提取后過(guò)濾，合并濾液，濃縮至乙醇無(wú)醇味，將浸膏加濃鹽酸調(diào)pH 1.0，放置12 h。離心，取沉淀物進(jìn)行干燥，加水，70℃水浴加熱，10%NaOH溶液調(diào)至pH 7.0。加入45%乙醇，放置1 h，抽濾，沉淀用45%乙醇洗滌，濾液加濃鹽酸調(diào)到pH 1.0，80℃下保溫1.5 h，放置10 h，抽濾，所得沉淀干燥，即得。并用紫外分光光度法測(cè)固體物中的總黃酮含量。與其他的純化工藝相比較，其提取成本低廉，工藝簡(jiǎn)單，適合于工業(yè)生產(chǎn)，有一定的實(shí)用價(jià)值。

[1]普拉.黃芩的主要成分及其藥理作用[J].山東畜牧獸醫(yī)，2014，35（4），76.

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Optimization of purification for injective extract from Scutellaria baicalensis stems and leaves

ZHU LeiLI JunDONG HairongWANG ChunminJingfukang Pharmaceutical Group the New Excipients of Traditional Chinese Medicine Engineering Research Center of Hebei,Hebei Province,Chengde067000,China

Objective To optimize the method of purifying the extract of Scutellariae baicalensis stems and leaves(SBSL)so as to provide an experimental basis for the separation and purification of total flavonoids of SBSL.Methods Four methods including acid precipitation,acid-alkali method,alkali extraction and acid precipitation,recrystallization method were compared for the optimization of purification of total flavonoids,with the purity rate and transferring rate of total flavonoids as the indexes.Results By using the above-mentioned four methods,the transfer rate of total flavonoids were 64%,59%,54%and 62%;and the purification were 48%,78%,69%and 47%respectively.Conclusion Among the four methods,acid-alkali method shows better purification effect of SBSL,which provides experimental basis for reasonable purification of SBSL,and shows guiding significance for industrial production at large scale.

Scutellaria baicalensis stem leaf;UV spectrophotometry;Purification process;Orthogonal test

Q6.332

A

1673-7210（2014）11（b）-0090-04

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)2011BAI07B04）。