羅 勁 陳一強(qiáng) 孔晉亮 鄔麗紅 黃 宏

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸疾病研究所，廣西南寧 530021

煙曲霉是導(dǎo)致臨床免疫力低下患者肺部真菌感染的常見(jiàn)病原體之一。近年來(lái)雖然新型抗曲霉菌藥物的研發(fā)取得了一定的進(jìn)展，但唑類耐藥和多重耐藥菌株的出現(xiàn)，使煙曲霉感染的患者病死率依舊很高。體外研究發(fā)現(xiàn)，生物被膜形成是煙曲霉產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制之一，且生物被膜一旦成熟，其耐藥性將提高幾十、幾百甚至上千倍[1]，控制難治性煙曲霉感染成為當(dāng)前臨床治療上面臨的一大難題。因此若能夠?qū)で笠环N能夠有效破壞已經(jīng)形成的煙曲霉生物被膜的藥物或方法，或?qū)⒂兄诮鉀Q這一難題。金銀花主要抗真菌活性成分為綠原酸和異綠原酸[2-3]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸能破壞銅綠假單胞菌及煙曲霉生物被膜[4-5]，而目前異綠原酸對(duì)生物被膜相關(guān)生物學(xué)作用罕有報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)旨在探究異綠原酸對(duì)不同時(shí)期煙曲霉生物被膜的體外作用，為控制生物被膜藥物的研發(fā)在原料選擇方面提供更多科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）2012年5月~2013年9月臨床分離煙曲霉共31株，用結(jié)晶紫染色法測(cè)定成膜能力，選取成膜能力最強(qiáng)煙曲霉菌株（編號(hào)為A.f4）為實(shí)驗(yàn)菌株。質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌ATCC22019由我院臨床微生物檢驗(yàn)鑒定中心提供。

1.2 主要試劑

異綠原酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111782-201204）以最大溶解度溶解于二甲基椏楓（DMSO，Solarbio公司），0.22 μm 濾器濾過(guò)后于-20℃保存；結(jié)晶紫粉末（天津紅巖試劑廠）溶解于滅菌去離子水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的結(jié)晶紫染液；RMPI-1640粉（Gibico 公司）；3-（N-嗎啉基）丙磺酸-4-嗎啉丙磺酸（MOPS，美國(guó) Sigma 公司）；LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability死活菌染色試劑盒（Invitrogen公司）；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA，中國(guó)路橋技術(shù)責(zé)任有限公司）；分析純無(wú)水乙醇（天津Kermel化學(xué)試劑有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）粉（美國(guó) sigma公司）。

1.3 儀器

圓形玻璃細(xì)胞爬片（直徑13 mm，天津博泰克科技公司）作為構(gòu)建生物被膜的載體，高壓滅菌備用；生物安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司BHC-1300IIA/B2）；智能生化培養(yǎng)箱（常州市偉嘉儀器制造有限公司 SPX250）；酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo Multiskan MK3）；掃描電鏡（日立SU8020）；激光共聚焦顯微鏡（CLSM，Nikon A1）。

1.4 方法

1.4.1 孢子懸液的制備 將受試的煙曲霉菌株A.f4接種至PDA斜面，37℃恒溫復(fù)蘇3 d后，轉(zhuǎn)種于另一PDA培養(yǎng)基37℃活化3 d，用5 mL含0.025%Tween-20的PBS沖洗斜面收集孢子，20 mL MOPS緩沖后pH為7.0的RPMI-1640重懸孢子，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度為1×105個(gè)/mL，作為建立煙曲霉體外靜止生物被膜模型的孢子懸液。

1.4.2 異綠原酸的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MFC）測(cè)定 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（clinical and laboratory standards institute，CLSI）M38-A2 絲狀真菌藥敏指南[6]并做適當(dāng)調(diào)整，測(cè)定異綠原酸對(duì)受試菌株A.f4及質(zhì)控菌株的MIC和MFC。其中異綠原酸最終受試濃度為 2~1024 μg/mL（1024 μg/mL 為最大溶解度，且各濃度含DMSO終體積分?jǐn)?shù)≤1%）。

1.4.3 體外煙曲霉靜止生物被膜模型的建立 參考Mowat等[7]的方法，往無(wú)菌24孔板各孔加入1個(gè)滅菌生物被膜載體及1 mL制備好的孢子懸液，靜置于生化培養(yǎng)箱，分別于37℃恒溫孵育24 h和48 h，在載體上形成早期、成熟期煙曲霉生物被膜。培養(yǎng)期間每隔24小時(shí)更換1次RPMI-1640培養(yǎng)液。

1.4.4 CLSM檢測(cè)經(jīng)異綠原酸作用后不同時(shí)期生物被膜內(nèi)死活菌 建模后，異綠原酸組加入1024 μg/mL的異綠原酸，空白對(duì)照組則加入RPMI-1640培養(yǎng)液；加藥前各孔分別用滅菌PBS輕輕漂洗生物被膜表面3次除去未黏附菌。藥物作用48 h（期間每隔24小時(shí)用相同的液體換液1次）后將載體取出，以滅菌PBS輕輕漂洗生物被膜表面3次。按照LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability試劑盒的使用說(shuō)明，將碘化丙啶（PI）及Syto-9熒光染料按1∶1比例配制好后用滅菌去離子水稀釋500倍，取200 μL加入各孔沒(méi)過(guò)載體，室溫避光染色15 min，無(wú)菌PBS輕輕漂去未黏附染料，自然干燥后置于CLSM下放大200倍觀察。

1.4.5 SEM觀察異綠原酸對(duì)不同時(shí)期生物被膜的形態(tài)干預(yù) 建模、分組同CLSM。藥物作用48 h（期間每隔24小時(shí)分別用相同的液體換液）后將載體取出，滅菌PBS輕輕漂去載體表面的浮游菌，2.5%戊二醛固定24 h，依次用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水并干燥后，真空噴鍍金粉，于20 kV電壓、放大2000倍條件下進(jìn)行掃描電鏡（SEM）形態(tài)學(xué)觀察。

1.4.6 結(jié)晶紫染色法對(duì)不同濃度異綠原酸作用于不同時(shí)期生物被膜后的定量分析 按照上述方法建模后，用滅菌PBS輕輕漂洗生物被膜表面3次以去除未黏附菌。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果將實(shí)驗(yàn)分為：空白對(duì)照組、不同濃度異綠原酸組（64、128、256、512、1024 μg/mL），異綠原酸組加入上述濃度的藥物，空白對(duì)照組加入新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液。藥物作用48 h（期間每隔24 h各組分別用相同的液體換液），取出各組載體，參照Peeters等[8]及Shao等[9]的方法并做適當(dāng)改進(jìn)：滅菌PBS緩沖液輕輕漂去生物被膜表面的浮游菌，室溫干燥后將載體置于新的24孔板中，加入1%結(jié)晶紫1 mL染色15 min。再次輕輕漂洗生物被膜表面未黏附的結(jié)晶紫，室溫干燥后加入1 mL無(wú)水乙醇脫色10 min。吸取100 μL洗脫液加入96孔板，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值（A570），以無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照。各組每次分別設(shè)置3個(gè)副孔取其平均值，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析及SNK檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異綠原酸的MIC和MFC測(cè)定結(jié)果

根據(jù)CLSI M38-A2絲狀真菌藥敏指南判讀標(biāo)準(zhǔn)，異綠原酸對(duì)受試煙曲霉A.f4菌株及質(zhì)控菌株的MIC和MFC均大于1024 μg/mL。

2.2 各組CLSM檢測(cè)結(jié)果比較

成熟期煙曲霉生物被膜內(nèi)菌絲密度較早期更為密集。無(wú)論早期或成熟期，藥物作用48 h后，空白對(duì)照組和異綠原酸組生物被膜內(nèi)的菌絲均以具有活力的綠色為主，幾乎沒(méi)有出現(xiàn)紅色死亡狀態(tài)的菌絲。見(jiàn)圖 1（封三）。

2.3 SEM觀察結(jié)果

2.3.1 對(duì)早期煙曲霉生物被膜破壞作用 空白對(duì)照組的菌絲大部分被黏稠的胞外基質(zhì)包裹使之相互黏附形成致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，僅能隱約看到部分菌絲輪廓，見(jiàn)圖2（A）；經(jīng)異綠原酸作用后，胞外基質(zhì)明顯減少，菌絲輪廓飽滿，清晰可見(jiàn)，見(jiàn)圖2（B）。

2.3.2 異綠原酸對(duì)成熟期煙曲霉生物被膜破壞作用與早期相比，成熟期的生物被膜結(jié)構(gòu)更加致密?？瞻讓?duì)照組煙曲霉菌絲表面完全被濃密厚實(shí)的胞外基質(zhì)包裹，幾乎看不到菌絲的輪廓，見(jiàn)圖2（C）；異綠原酸組的菌絲表面雖然仍有殘留少量的胞外基質(zhì)，但相對(duì)于同時(shí)期空白對(duì)照組而言，胞外基質(zhì)已經(jīng)明顯減少，菌絲輪廓更為清晰，見(jiàn)圖2（D）。

2.4 結(jié)晶紫染色法對(duì)異綠原酸作用于不同時(shí)期生物被膜后的定量結(jié)果

無(wú)論早期或成熟期的生物被膜，當(dāng)異綠原酸作用濃度達(dá) 256 μg/mL 及以上時(shí)，即 256、512、1024 μg/mL異綠原酸組的A570值與同期空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；64、128 μg/mL 異綠原酸組的A570值與同期空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05）；256、512、1024 μg/mL 異綠原酸組 A570值兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即隨著異綠原酸濃度增加，生物被膜減少更明顯；濃度低于256 μg/mL異綠原酸組對(duì)載體上生物被膜量影響與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

圖2 不同時(shí)期煙曲霉生物被膜形態(tài)學(xué)（SEM，2000×）

表1 異綠原酸作用于不同時(shí)期煙曲霉生物被膜后結(jié)晶紫染色法定量結(jié)果比較（x±s，n=3）

具有成膜能力的煙曲霉臨床分離菌株在體外培養(yǎng)24 h后，可獲得由多層菌絲有序排列形成具有復(fù)雜三維立體結(jié)構(gòu)特征的多細(xì)胞菌落，即早期生物被膜，48 h后生物被膜逐漸成熟即成熟期生物被膜[10-11]。生物被膜形成以后，煙曲霉對(duì)常用抗真菌藥物如兩性霉素B及其脂質(zhì)體、伏立康唑、伊曲康唑、卡泊芬凈、米卡芬凈等抗真菌藥的敏感性均下降[12]，且生物被膜越成熟，包裹在生物被膜內(nèi)的菌體耐藥性越明顯。胞外基質(zhì)是構(gòu)成生物被膜的基礎(chǔ)物質(zhì)，其主要成分為多糖（半乳糖甘露聚糖，α-1，3-葡聚糖）、單糖、多元醇、疏水蛋白及各種抗原等。胞外基質(zhì)帶負(fù)電荷，可以吸收多肽鏈中帶正電荷的氨基側(cè)鏈，從而形成一道疏水屏障，阻礙親水性抗真菌藥物滲入菌體發(fā)揮殺菌作用[13]。隨著煙曲霉生物被膜的成熟或在唑類藥物誘導(dǎo)條件下，多耐藥蛋白（MDR4）等多耐藥基因表達(dá)會(huì)明顯上調(diào)，其轉(zhuǎn)錄翻譯出的MDR能介導(dǎo)菌體對(duì)藥物的外排作用，降低細(xì)胞膜通透性，從而減少抗真菌藥物在菌體內(nèi)的蓄積量[14]。煙曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物膠霉毒素隨著生物被膜的形成和成熟，產(chǎn)生量不斷增加，使煙曲霉菌體得以避開(kāi)宿主免疫系統(tǒng)的攻擊并長(zhǎng)期在宿主體內(nèi)生存[15]，這可能也是其發(fā)生耐藥的機(jī)制之一。

金銀花是清熱解毒中藥，其活性成分綠原酸類主要包括綠原酸（單咖啡?？鼘幩幔┖彤惥G原酸（二咖啡?？鼘幩幔?，具有體外抗炎、抗菌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用。綠原酸類物質(zhì)的抗真菌機(jī)制主要與其立體結(jié)構(gòu)和棘白菌素類抗真菌藥物結(jié)構(gòu)具有相似性有關(guān)[2，16-17]。異綠原酸在金銀花活性成分中的構(gòu)成比僅次于綠原酸，化學(xué)結(jié)構(gòu)比綠原酸多一個(gè)咖啡?；瑑烧咄瑢儆诒奖仡惢衔?。本研究以最大溶解度的異綠原酸稀釋100倍（1024 μg/mL）后作用于煙曲霉早期及成熟期生物被膜，CLSM觀察到生物被膜內(nèi)的菌絲仍有活力，說(shuō)明亞抑菌濃度的異綠原酸對(duì)菌絲本身沒(méi)有直接殺菌作用。SEM及結(jié)晶紫染色法定量結(jié)果證實(shí)異綠原酸可以使包裹菌絲的胞外基質(zhì)明顯減少，且隨著其濃度增高（≥256 μg/mL），生物被膜減少愈顯著，即異綠原酸能夠抑制或降解胞外基質(zhì)，破壞不同時(shí)期的煙曲霉生物被膜結(jié)構(gòu)，其作用呈濃度依賴性。異綠原酸對(duì)成熟期生物被膜破壞作用不如早期生物被膜明顯，這可能與成熟期生物被膜培養(yǎng)周期更長(zhǎng)，胞外基質(zhì)更濃厚，藥物作用時(shí)間不足或菌體對(duì)藥物外排作用隨生物被膜成熟而增強(qiáng)有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究；可以推測(cè)，若能在生物被膜形成的早期階段，用異綠原酸干預(yù)胞外基質(zhì)形成或破壞其結(jié)構(gòu)，減弱生物被膜屏障作用，并聯(lián)合使用抗真菌藥物，可增強(qiáng)藥物的滲透并在菌體內(nèi)達(dá)到有效蓄積量，從而發(fā)揮其殺菌活性，同時(shí)還能減輕大劑量應(yīng)用抗真菌藥物給機(jī)體帶來(lái)的毒副作用，解決當(dāng)前治療生物被膜相關(guān)感染在藥物選擇方面捉襟見(jiàn)肘的現(xiàn)狀。本課題組后期將通過(guò)進(jìn)一步聯(lián)合抗真菌藥物實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)這一猜想。異綠原酸主要來(lái)源于金銀花，其產(chǎn)地遍布全國(guó)各省，原材料豐富，取材便利，若能應(yīng)用于臨床治療煙曲霉生物被膜相關(guān)感染，將極大降低藥物成本，節(jié)約醫(yī)療費(fèi)用，增加經(jīng)濟(jì)效益。本實(shí)驗(yàn)結(jié)論進(jìn)一步拓展了中藥金銀花活性成分的功效范圍，使其臨床醫(yī)療應(yīng)用前景更加廣闊。

[1]Seidler MJ，Salvenmoser S，Muller FM，et al.Aspergillus Fumigatus forms biofilms with reduced antifungal drug susceptibility on bronchial epithelial cells[J].Antimicrob Agents Chemother，2008，52（11）：4130-4136.

[2]MaCM，KullyM，KhanJK，etal.Synthesisof chlorogenic acid derivatives with promising antifungal activity[J].Bioorg Med Chem，2007，15（21）：6830-6833.

[3]Ozcelik B，Kartal M，Orhan I，et al.Cytotoxicity，antiviral and antimicrobial activities of alkaloids，flavonoids，and phenolic acids[J].Pharm Biol，2011，49（4）：396-402.

[4]溫紅俠，陳一強(qiáng)，朱蓮娜，等.綠原酸對(duì)銅綠假單胞菌生物膜干預(yù)作用的體外研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009，12（12）：1478-1481.

[5]鄔麗紅，陳一強(qiáng)，孔晉亮，等.金銀花主要活性成分對(duì)煙曲霉生物膜的體外影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2014，6（6）：1-4.

[6]John HR，Barbara DA，Beth AS，et al.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi，approved standard-second edition M38-A2[S].Clinical Laboratory Standards Institute，2008：1-35.

[7]Mowat E，Butcher J，Lang S，et al.Development of a simple model for studying the effects of antifungal agents on multicellular communities of Aspergillus Fumigatus[J].J Med Microbiol，2007，56（Pt9）：1205-1212.

[8]Peeters E，Nelis HJ，Coenye T，et al.Comparison of multiple methods for quantification of microbia biofilms grown in microtiterplates[J].JMicrobiolMethods，2008，72（2）：157-165.

[9]Shao J，Cheng H，Wu D，et al.Antimicrobial effect of sodium houttuyfonate on staphylococcus epidermidis and candida albicans biofilms[J].J Tradit Chin Med，2013，33（6）：798-803.

[10]唐夢(mèng)丹，鄭建鋒，趙敬軍.曲霉生物膜研究進(jìn)展[A].2012全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編，2012：1.

[11]Kaur S，Singh S.Biofilm formation by Aspergillus Fumigatus[J].MedMycol，2014，52（1）：2-9.

[12]Arendrup MC.Update on antifungal resistance in Aspergillus and Candida[J].Clin Microbiol Infect，2014，20（Suppl6）：42-8.

[13]Mowat E，Lang S，Williams C，et al.Phase-dependent antifungal activity against Aspergillus Fumigatus developing multicellular filamentous biofilms[J].J Antimicrob Chemother，2008，62（6）：1281-1284.

[14]Rajendran R，Mowat E，Mcculloch E，et al.Azole resistance of Aspergillus Fumigatus biofilms is partly associated with efflux pump activity [J].Antimicrob Agents Chemother，2011，55（5）：2092-2097.

[15]Bruns S，Seidler M，Albrecht D，et al.Functional genomic profiling of Aspergillus Fumigatus biofilm reveals enhanced production of the mycotoxin gliotoxin[J].Proteomics，2010，10（17）：3097-3107.

[16]Karunanidhi A，Thomas R，Van belkum A，et al.In vitro antibacterial and antibiofilm activities of chlorogenic acid against clinical isolates of stenotrophomonas maltophilia including the Trimethoprim/Sulfamethoxazoleresistant strain[J].Biomed Res Int，2013，2013（12）：392-458.

[17]Sung WS，Lee DG.Antifungal action of chlorogenic acid against pathogenic fungi，mediated by membrane disruption[J].Pure and Applied Chemistry，2010，82（1）：219-226.