沈薇等

[摘要] 目的 探討去甲基化藥物5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）對人胃癌細(xì)胞BGC803增殖、凋亡及對死亡相關(guān)蛋白激酶（DAPK）mRNA表達水平的影響。 方法 用不同濃度的5-Aza-CdR處理BGC803細(xì)胞，設(shè)立不含5-Aza-CdR的對照組及3個實驗組：5-Aza-CdR 1 μmol/L組、5-Aza-CdR 5 μmol/L組、5-Aza-CdR 10 μmol/L組。CCK-8檢測細(xì)胞的增殖情況，AnnexinⅤ/PI雙染及流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物處理后細(xì)胞凋亡的情況，RT-PCR檢測用藥前后DAPK mRNA的表達水平變化。 結(jié)果 實驗組BGC803細(xì)胞增殖速度顯著低于對照組，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P < 0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示，BGC803細(xì)胞中DAPK基本無表達，5-Aza-CdR處理后，細(xì)胞中DAPK mRNA表達量顯著高于對照組（P < 0.05）。 結(jié)論 5-Aza-CdR抑制BGC803細(xì)胞增殖，并促進細(xì)胞凋亡，可能與其誘導(dǎo)DAPK基因表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 5-氮雜-2'-脫氧胞苷；死亡相關(guān)蛋白激酶；胃癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號] R734.2 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）11（b）-0014-04

[Abstract] Ojective To explore the effects of DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine （5-Aza-CdR） on the proliferation， apoptosis and the expression level of tumor suppressor gene DAPK in human gastric cancer cell line BGC803 cells. Methods BGC803 cells were treated with different concentrations of 5-Aza-CdR and divided into four groups， including control group， 5-Aza-CdR 1 μmol/L group，5-Aza-CdR 5 μmol/L group and 5-Aza-CdR 10 μmol/L group. Cell counting Kit-8 was employed to detect cell proliferation， cell apoptosis was measured by AnnexinⅤ/PI apoptosis detection kit， RT-PCR was applied to detect the DAPK mRNA expression. Results The proliferation of BGC803 cells was significantly inhibited in a dose-dependent manner compared with control group， after 5-Aza-CdR treatment， the apoptotic rates of cells increased significantly （P < 0.05）. The expression levels of DAPK mRNA was gradually increased in a time-dependent manner （P < 0.05）. Conclusion 5-Aza-CdR inhibited cells proliferation， promoted cells apoptosis and induced the expression of DAPK gene in BGC803 cells.

[Key words] 5-Aza-2'-deoxycytidine； Death-associated protein kinase； Gastric cancer； Cell proliferation； Cell apoptosis

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，每年因胃癌死亡的人數(shù)位居癌癥死因第2位[1]。胃癌的發(fā)生發(fā)展是涉及多個基因的復(fù)雜過程，與抑癌基因的異常改變密切相關(guān)。腫瘤表觀遺傳學(xué)認(rèn)為基因啟動子區(qū)CpG島甲基化是抑癌基因表達下調(diào)甚至失活的重要機制，但這種變化是可逆轉(zhuǎn)的，去甲基化藥物能夠逆轉(zhuǎn)抑癌基因啟動子甲基化狀態(tài)，恢復(fù)其正常表達[2]。死亡相關(guān)蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）是一種凋亡正向調(diào)節(jié)分子，可被腫瘤壞死因子α、神經(jīng)酰胺、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）存活信號和pl9AFR5等多種因子激活，進而誘導(dǎo)凋亡[3]。有研究表明在頭頸部腫瘤、胃癌、肺癌及膀胱癌等多種腫瘤細(xì)胞中，DAPK啟動子區(qū)域DNA高甲基化水平與該基因表達沉默有關(guān)[4-7]。Satoh等[8]發(fā)現(xiàn)15%的胃癌組織存在DAPK基因啟動子區(qū)CpG島甲基化。本文以人胃癌BGC803細(xì)胞株為研究對象，研究體外去甲基化藥物5-雜氮-2'脫氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR）對胃癌細(xì)胞株增殖、凋亡及細(xì)胞中DAPK基因的表達影響，為探討胃癌的發(fā)生發(fā)展機制及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

BGC803細(xì)胞來源于中國醫(yī)科大學(xué)遺傳學(xué)教研室，5-Aza-CdR購自美國Sigma公司，CCK-8購自北京碧云天公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，總RNA提取試劑盒，RT-PCR試劑盒，GoTaq Master Mix購自美國Promega公司，AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及藥物處理 RPMI1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清，100 μ/mL 青霉素，100 μ/mL鏈霉素）在37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)BGC803細(xì)胞。培養(yǎng)至60%匯合度時，對照組使用不含5-Aza-CdR的普通完全培養(yǎng)液，實驗組分別為加入不同濃度5-Aza-CdR處理液分別記為5-Aza-CdR 1 μmol/L組、5-Aza-CdR 5 μmol/L組、5-Aza-CdR 10 μmol/L組，每隔24小時換液1次。

1.2.2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖變化 將各組BGC803細(xì)胞按1500/孔接種96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，測定450 nm波長OD值，連測3 d，以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。以上實驗重復(fù)3次。

1.2.3 AnnexinⅤ/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率變化 細(xì)胞傳代24 h后，實驗組將5-Aza-CdR 10 μmol/L濃度配制的培養(yǎng)液加入培養(yǎng)瓶中，對照組換普通培養(yǎng)掖，每24小時換液1次。待72 h后分別回收細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，再用PBS離心洗滌，調(diào)整待測細(xì)胞密度為1×106個/mL。取1 mL細(xì)胞，1000 r/min， 4℃離心10 min，棄上清液，加入PBS清洗細(xì)胞2次，將細(xì)胞重懸于100 μL結(jié)合緩沖液，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和10 μL PI輕輕混勻，避光室溫孵育15 min后，加入400 μL結(jié)合緩沖液，立即FCM檢測。

1.2.4 半定量RT-PCR 檢測各組細(xì)胞DAPK mRNA 表達變化 用總RNA提取試劑盒提取5-Aza-CdR 10 μmol/L組不同處理時間（0、24、48、72 h）的細(xì)胞內(nèi)RNA，用兩步法將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA后進行PCR實驗，DAPK引物序列為5'-GATAGAAATGTCCCCAAA-3'（上游）；5'-TCTTCTTTGGATCCTTGA-3'（下游），長度為343 bp。作為內(nèi)參的人β-actin引物序列為5'-CCAGATCATGTTTGAGACCT-3'（上游）；5'-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3'（下游），長度為480 bp。擴增反應(yīng)條件：95℃ 5 min變性，95℃復(fù)性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃暫時保存。實驗重復(fù)3次。產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-2500 R）拍照及分析表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團。DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則使基因重新活化和表達。抑癌基因啟動子區(qū)域CpG島高度甲基化可導(dǎo)致相關(guān)基因表達沉默，從而直接參與、影響或調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，是癌癥發(fā)生的重要機制[9]。由于DNA甲基化修飾不涉及DNA序列改變，這種改變是可逆的。5-Aza-CdR是一種高效的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）抑制劑，它可與DNMT不可逆性結(jié)合，具有較強的去甲基化作用，恢復(fù)表觀遺傳學(xué)沉默的基因的表達水平，糾正腫瘤細(xì)胞的異常生物學(xué)特征[10-11]。目前5-Aza-CdR已在臨床急性粒細(xì)胞白血病的治療中得到較成功的應(yīng)用[12]。Wang等[13]報道，胃癌SGC7901和BGC823細(xì)胞經(jīng)5-Aza-CdR處理后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制。本研究用不同濃度去甲基化藥物（5-Aza-CdR）處理胃癌細(xì)胞BGC803細(xì)胞72 h后，發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR能明顯抑制細(xì)胞的增殖。

本研究顯示，5-Aza-CdR對胃癌BGC803細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用。腫瘤細(xì)胞凋亡受眾多凋亡相關(guān)基因調(diào)控。DAPK是一種鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于細(xì)胞凋亡的正調(diào)控因子，廣泛參與多種途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]。在多種腫瘤中已發(fā)現(xiàn)DAPK基因CpG島有不同程度的高甲基化，DAPK表達明顯受到抑制[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌BGC803細(xì)胞中DAPK mRNA表達水平很弱，使用10 μmol/L 5-Aza-CdR處理細(xì)胞后，可恢復(fù)DAPK mRNA表達并呈時間依賴性升高，并且基因的表達狀況與細(xì)胞的生長狀況平行。由此提示，5-Aza-CdR可能通過恢復(fù)DAPK基因CpG島的去甲基化水平，使基因恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性，從而誘導(dǎo)其重新表達，發(fā)揮DAPK的腫瘤抑制作用。其具體甲基化的改變狀態(tài)尚需進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR抑制胃癌細(xì)胞BGC803增殖及誘導(dǎo)凋亡，可能與其去甲基化恢復(fù)DAPK基因表達及功能有關(guān)，這為胃癌的診斷及去甲基化治療提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2014-08-10 本文編輯：蘇 暢）