叢 敬 郭 麗丁曉慧 吳景東 宮 倩

1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，遼寧沈陽(yáng)110034；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng)110034；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)生處，遼寧沈陽(yáng)110031；4.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110034

絞股藍(lán)皂苷對(duì)人衰老皮膚成纖維細(xì)胞抗氧化酶活性的影響

叢 敬1郭 麗2丁曉慧1吳景東3宮 倩4

1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，遼寧沈陽(yáng)110034；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng)110034；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)生處，遼寧沈陽(yáng)110031；4.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110034

目的在細(xì)胞水平研究絞股藍(lán)皂苷對(duì)抗氧化酶活性的影響。方法原代培養(yǎng)并建立人衰老皮膚成纖維細(xì)胞系，0、5、10、15 mg/L絞股藍(lán)皂苷處理細(xì)胞，24、72、96 h后，四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖；72 h后檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性。結(jié)果藥物作用24、72 h后，10、15mg/L絞股藍(lán)皂苷可以促進(jìn)人衰老成纖維細(xì)胞增殖，增殖效應(yīng)呈時(shí)間和濃度依賴（P＜0.05）。與0 mg/L比較，10、15 mg/L絞股藍(lán)皂苷可以增強(qiáng)細(xì)胞SOD、CAT、GSH-Px活性（P＜0.05），且與10mg/L絞股藍(lán)皂苷比較，15 mg/L絞股藍(lán)皂苷能夠顯著提高SOD和GSH-Px活性（P＜0.05）。結(jié)論絞股藍(lán)皂苷可以通過(guò)提高SOD、CAT、GSH-Px活性，削弱氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)細(xì)胞的損傷，使細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，延緩細(xì)胞衰老。

絞股藍(lán)皂苷；成纖維細(xì)胞；超氧化物歧化酶；過(guò)氧化氫酶；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶；衰老皮膚

衰老是一種多環(huán)節(jié)的生物學(xué)過(guò)程，是機(jī)體在退化時(shí)期功能下降和紊亂的綜合表現(xiàn)，是體內(nèi)各臟器細(xì)胞功能減低的現(xiàn)象[1]。成纖維細(xì)胞對(duì)于膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的合成下降是皮膚衰老的重要特征[2]。絞股藍(lán)是葫蘆科草質(zhì)藤本植物，是五加科之外唯一含有與人參皂苷相似結(jié)構(gòu)皂苷的植物，其皂苷成分具有保護(hù)心腦血管、抗腦缺氧、抗腫瘤及抗衰老等藥理作用，并在治療高血脂癥、血管性癡呆、消化道潰瘍以及中風(fēng)等方面取得了一定的療效，因此引起國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者的重視[3]。本實(shí)驗(yàn)研究絞股藍(lán)皂苷對(duì)于人衰老皮膚成纖維細(xì)胞多種抗氧化酶活性的影響，淺探其在細(xì)胞水平的抗衰老作用和機(jī)制，為絞股藍(lán)的進(jìn)一步臨床應(yīng)用及市場(chǎng)開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皮膚標(biāo)本3例，取自施行眼袋切除術(shù)和倒睫矯正術(shù)的老年女性眼瞼周圍的正常皮膚，年齡55～60歲，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院眼科提供。絞股藍(lán)皂苷，成都曼思特生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，美國(guó)GIBCO公司；胰蛋白酶，美國(guó)Sigma公司；磷酸鹽緩沖液，中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒，南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立細(xì)胞系及分組皮膚標(biāo)本用膠原酶消化，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中植塊法原代培養(yǎng)，建立衰老的人皮膚成纖維細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)選用第3～6代細(xì)胞，分為0、5、10、15mg/L絞股藍(lán)皂苷組，即A、B、C、D組，給予對(duì)應(yīng)濃度的絞股藍(lán)皂苷處理細(xì)胞，24、72、96 h后，四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；72 h后，檢測(cè)SOD、CAT、GSH-Px活性。

1.2.2 制備絞股藍(lán)皂苷取0.1 g絞股藍(lán)皂苷溶于1mL二甲基亞砜（DMSO），配成0.1mg/L的貯存液，DMEM培養(yǎng)液倍比稀釋，使其終濃度分別為5、10、15mg/L。1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖制備單細(xì)胞懸液，接種于96孔板上，分別加入絞股藍(lán)皂苷0、5、10、15μg/mL，同時(shí)根據(jù)DMSO的濃度做相應(yīng)溶劑對(duì)照，每組細(xì)胞的藥物濃度孔及相應(yīng)溶劑對(duì)照孔均做5復(fù)孔。另做1孔不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液和絞股藍(lán)皂苷。共做3塊培養(yǎng)板。培養(yǎng)24、72、96 h各取出1塊培養(yǎng)板，MTT法檢測(cè)各孔吸光度值[4]。

1.2.4 細(xì)胞抗氧化酶活性測(cè)定分別收集各組細(xì)胞，超聲破碎，離心取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法測(cè)定SOD、CAT、GSH-Px活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，方差齊時(shí)，行單因素方差分析，LSD-t法進(jìn)行多組間兩兩比較；方差不齊時(shí)，采用非參數(shù)分析進(jìn)行多組間比較，Dunnett T3法進(jìn)行多組間兩兩比較[5]。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 絞股藍(lán)皂苷濃度和作用時(shí)間對(duì)衰老成纖維細(xì)胞增殖的影響

加入不同濃度絞股藍(lán)皂苷，培養(yǎng)24、72、96 h可見(jiàn)，各組細(xì)胞均繼續(xù)生長(zhǎng)，其中24 h及72 h細(xì)胞生長(zhǎng)較快，至96 h細(xì)胞生長(zhǎng)放緩。培養(yǎng)24、72 h時(shí)，與A組比較，B組無(wú)促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，C組、D組表現(xiàn)為增殖促進(jìn)（P＜0.05），且D組的增殖促進(jìn)作用更強(qiáng)（P＜0.05）。培養(yǎng)96 h時(shí)，呈飽和狀態(tài)，藥物濃度對(duì)細(xì)胞增殖作用組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 絞股藍(lán)皂苷濃度和作用時(shí)間對(duì)衰老成纖維細(xì)胞增殖的影響

2.2 濃度對(duì)衰老成纖維細(xì)胞抗氧化酶活性的影響

SOD活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與A組比較，B組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；C組、D組細(xì)胞SOD活性提升（P＜0.05），且D組作用更強(qiáng)（P＜0.05）。CAT活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與A組比較，B組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；C組、D組細(xì)胞CAT活性增強(qiáng)（P＜0.05）。GSH-Px活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與A組比較，B組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；C組、D組細(xì)胞GSH-Px活性均有不同程度增強(qiáng)（P＜0.05），且D組增強(qiáng)更顯著（P＜0.05）。提示絞股藍(lán)皂苷可提高人衰老皮膚成纖維細(xì)胞SOD、CAT、GSH-Px活性，且呈濃度依賴。見(jiàn)表1。

表1 濃度對(duì)衰老成纖維細(xì)胞抗氧化酶活性的影響（kU/L，s）

表1 濃度對(duì)衰老成纖維細(xì)胞抗氧化酶活性的影響（kU/L，s）

注：與A組比較，△P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05；SOD：超氧化物歧化酶；CAT：過(guò)氧化氫酶；GSH-Px：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶

?

3 討論

衰老的自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為皮膚細(xì)胞的內(nèi)源性衰老和外源性衰老有著共同的分子機(jī)制，即均遭受活性氧（ROS）所致的氧化應(yīng)激，并引發(fā)一系列后續(xù)效應(yīng)。ROS不僅能直接損害線粒體導(dǎo)致能量產(chǎn)生不足和鈣平衡紊亂，還能直接損傷細(xì)胞膜脂質(zhì)、核酸、酶和受體等生物大分子，導(dǎo)致生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化、基因穩(wěn)態(tài)失衡或基因突變，蛋白質(zhì)羥基化、酶失活；與此同時(shí)，清除自由基的抗氧化酶的活性不斷下降使體內(nèi)的自由基物質(zhì)過(guò)剩，最終導(dǎo)致衰老[6-7]。生物體內(nèi)具有多種抗氧化酶體系。SOD具有清除超氧陰離子、減輕過(guò)氧化損害、保護(hù)細(xì)胞免受自由基傷害的作用[8]。CAT可以利用H2O2氧化各種底物，使有毒物質(zhì)失活，同時(shí)催化H2O2分解為H2O與O2，是生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一[9]。GSH-Px是一種重要的過(guò)氧化物分解酶，它能催化谷胱甘肽變?yōu)檠趸凸入赘孰?，清除在?xì)胞呼吸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化物和羥自由基，使有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過(guò)氧化物的干擾及損害。在正常情況下，機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的超氧陰離子被細(xì)胞的SOD歧化為H2O2，后者再由CAT和GSH-Px催化降解[10]。

成纖維細(xì)胞合成分泌的纖維蛋白參與構(gòu)成了真皮層中細(xì)胞成分之外的所有組分。皮膚衰老的種種臨床表現(xiàn)都與成纖維細(xì)胞數(shù)量減少、合成功能下降或異常有關(guān)。有研究顯示，成纖維細(xì)胞從“年輕”向“老化”發(fā)展的進(jìn)程中，伴隨著DNA和蛋白質(zhì)的氧化損傷，細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的改變，細(xì)胞內(nèi)ROS水平逐漸增高[11]，抗氧化酶活性降低[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[13-14]表明，灌胃（0.8 m L/t）配以外用（5 g/t）絞股藍(lán)提取液可以增強(qiáng)自然衰老小鼠皮膚組織內(nèi)SOD、CAT的活性。絞股藍(lán)皂苷是絞股藍(lán)中提取出來(lái)的藥效成分。外用1.5%絞股藍(lán)皂苷霜可使光損傷模型小鼠表皮中抗氧化酶活性得到恢復(fù)，其抗氧化作用與維生素E霜相似[15]。本文研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，絞股藍(lán)皂苷可以在細(xì)胞水平提高抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性，拮抗ROS對(duì)成纖維細(xì)胞數(shù)量和功能的損傷，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，修復(fù)甚至提高其合成分泌功能，從而使改善皮膚衰老成為可能，但其具體的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步證實(shí)。關(guān)于人衰老皮膚成纖維細(xì)胞的相關(guān)研究可以為闡明皮膚衰老的機(jī)制，探尋細(xì)胞衰老與器官衰老之間的關(guān)系提供佐證。

[1]向芳，張國(guó)豪.皮膚衰老的研究進(jìn)展[J].貴州醫(yī)藥，2011，35（12）：1138-1140.

[2]Varani J，Dame MK，Rittie L，etal.Decreased collagen production in chronologically aged skin：roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation[J].Am JPathol，2006，168（6）：1861-1868.

[3]倪紅，李薇，熊哲，等.絞股藍(lán)皂苷藥理與臨床研究進(jìn)展[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，15（9）：44-46.

[4]王曦，石鈺，Viennet C，等.黃芪甲苷對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2006，12（2）：93-97.

[5]喻陸，史春夏.松花粉對(duì)衰老成纖維細(xì)胞線粒體DNA缺失突變的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2012，32（24）：5438-5441.

[6]Staal FJ，Luis TC.Wnt signaling in hematopoiesis：crucial factors for self-renewal，proliferation，and cell fate decisions[J].JCell Biochem，2010，109（5）：844-849.

[7]顏小芳，農(nóng)文田，藍(lán)賢俊，等.maFGF對(duì)慢性衰老大鼠自由基代謝的影響[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2011，13（2）：54-55.

[8]傅永錦，潘競(jìng)鏘，張小牧，等.水飛薊賓對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)衰老大鼠抑制糖氧化應(yīng)激反應(yīng)及改善學(xué)習(xí)記憶作用[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2012，17（1）：10-14.

[9]Kalyanaraman B.Teaching the basics of redox biology to medical and graduate students：Oxidants，antioxidants and diseasemechanisms[J].Redox Biol，2013，1（1）：244-257.

[10]李華，葉目亭杰，李伯勤，等.蟲(chóng)草多糖對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞抗氧化能力的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，4（2）：160-162.

[11]Nichols JA，Katiyar SK.Skin photoprotection by natural polyphenols：anti-inflammatory，antioxidant and DNA repairmechanisms[J].Arch Dermatol Res，2010，302（2）：71-83.

[12]Poljak B，Dahmane RG，Godi A.Intrinsic skin aging：the role of oxidative stress[J].Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat，2012，21（2）：33-36.

[13]王彩霞，王麗新.外用絞股藍(lán)對(duì)自然衰老小鼠皮膚組織中CAT活性、MDA含量影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2011，25（7）：29-31.

[14]王彩霞，吳景東.灌胃絞股藍(lán)提取液對(duì)自然衰老小鼠皮膚組織中SOD活性、MDA含量影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2008，22（12）：44-45.

[15]胡蓉，鄧丹琪，王醫(yī)林，等.絞股藍(lán)皂苷對(duì)光損傷小鼠表皮中抗氧化應(yīng)激酶的影響[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2010，24（6）：517-519.

Effect of gypenosides on antioxidative enzymes of human aged skin fibroblasts

CONG Jing1GUO Li2DING Xiaohui1WU Jingdong3GONG Qian4
1.Department of Histology and Embryology,Shenyang Medical College,Liaoning Province,Shenyang 110034,China; 2.Central Lab,Shenyang Medical College,Liaoning Province,Shenyang 110034,China;3.Students Affair Office, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Shenyang 110031,China;4.School of Basic Medicine,Shenyang Medical College,Liaoning Province,Shenyang 110034,China

Objective To study the effect of gypenosides(Gyp)on the activity of antioxidative enzymes at cellular level. Methods After the primary culture and subculture,human aged skin fibroblastswere incubated with Gyp(0,5,10,15 mg/L)for 24,72 and 96 h respectively.The MTTmethod was used to evaluate the cell proliferation and assay the biologic activities of Gyp in different time and different doses.Relative level of the activity of SOD,CAT and GSH-Px in cellsweremeasured by cytochemistry.Results Aged fibroblasts proliferation could be promoted by Gyp(10,15 mg/L) for 24,72 hours treatment(P＜0.05).The activity of SOD,CAT and GSH-Px increased in both group 10 and 15mg/L Gyp as compared with group 0mg/L(P＜0.05).Compared with 10mg/LGyp group,15 mg/LGyp group showed significantly increased in the activity of SOD and GSH-Px(P＜0.05).Conclusion Gyp protects the aged fibroblasts by weakening oxidative stress,increasing the activity of antioxidative enzymes,and therefore delay the cells ageing.

Gypenosides;Fibroblasts;SOD;CAT;GSH-Px;Aged skin

R-332

A

1673-7210（2014）01（b）-0032-03

2013-11-13本文編輯：程銘）