封玉玲，陳 杰，苗加偉，賴國旗，賈爽爽，李 晶*

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校病理學(xué)教研室，重慶404120;2.重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，重慶400016;3.重慶市婦幼保健院婦科，重慶404000)

結(jié)腸癌(colon cancer)好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處，發(fā)病率占胃腸道腫瘤第3 位。醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate，MPA)用于臨床治療乳腺癌及其他激素依賴性腫瘤［1］，但目前尚無研究關(guān)于MPA 在細(xì)胞內(nèi)、外液濃度分布的報道。本實驗通過構(gòu)建反相高效液相色譜法(RPHPLC)分析低分化人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞內(nèi)、外液MPA 含量，為研究其誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡與藥物在細(xì)胞間分布關(guān)系提供一種技術(shù)，也可作為研究同類激素藥物代謝動力學(xué)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料:LC-10AT 型高效液相色譜儀(日本島津公司)、醋酸甲羥孕酮(MPA，Sigma 公司)、SW480 人結(jié)腸癌細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所)。

1.2 方法:常規(guī)培養(yǎng)人低分化結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞，分為加藥處理組和不加藥處理組。

加藥處理組為SW480 細(xì)胞中分別加入25、50 和75 μmol/L MPA(共3 組，每組10 份)，24 和48 h 后終止培養(yǎng)。加藥組的培養(yǎng)液混入乙腈(1∶2，v/v)，渦旋1 min，4 ℃，15 000 r/min 離心15 min，吸取上清液2 mL 于離心管，氮氣吹干，復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至平底塑料管，獲SW480 細(xì)胞胞外液;接著裂解SW480 細(xì)胞，同法處理獲細(xì)胞內(nèi)液樣品。

不加藥組培養(yǎng)48 h 后，同上法獲空白樣品內(nèi)、外液。MPA 標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.0 mmol/L)分別稀釋SW480 空白細(xì)胞內(nèi)、外液配置標(biāo)準(zhǔn)系列，制備獲得2、5、10、20、50、100 和200 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液。進(jìn)樣高效液相色譜儀，以MPA 峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，MPA 濃度(X)為橫坐標(biāo)，直線回歸制作空白SW480 細(xì)胞內(nèi)液、外液標(biāo)準(zhǔn)曲線。

色譜分析條件。色譜柱:安捷倫C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:甲醇∶水=70∶30(v/v);流速:1 mL/min;檢測波長:243 nm;進(jìn)樣:20 μL;柱溫:室溫。

按上述色譜條件分別進(jìn)樣分析高、中、低濃度(5、20 和100 μmol/L)3 組SW480 細(xì)胞胞內(nèi)、外標(biāo)準(zhǔn)液各5 份，根據(jù)峰面積直線回歸方程法定量計算提取回收率。此外，4 ℃貯存上述細(xì)胞內(nèi)、外液，連續(xù)5 d 于日內(nèi)與日間進(jìn)樣HPLC，考察方法精密度和穩(wěn)定性。

加藥處理組細(xì)胞內(nèi)、外液樣品分別進(jìn)樣，分析測定它們所含MPA 濃度。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用SPSS windows 13.0 軟件處理。

2 結(jié)果

HPLC 檢測樣品MPA 分離過程中無其他細(xì)胞內(nèi)源雜質(zhì)干擾，保留時間約13.20 min，分離度大于1.5，峰形對稱。細(xì)胞外液標(biāo)準(zhǔn)系列回歸方程Y = 752176X + 729592(r =0.9998);細(xì)胞內(nèi)液標(biāo)準(zhǔn)系列回歸方程Y =751586X +728254(r=0.9996)。MPA 濃度在2～200 μmol/L 定量工作曲線的線性范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系(圖1，2)。

圖1 細(xì)胞外液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 1 Standard curve of outracellular MPA

圖2 細(xì)胞內(nèi)液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 2 Standard curve of intracellular MPA

本實驗日內(nèi)和日間RSD%均小于0.05，精密度高，樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定，并可至少儲存5 d。取10 倍信噪比為定量限，也即線性范圍最小的濃度為2 μmol/L。

同濃度隨孵育時間延長、相同培養(yǎng)時間隨給藥濃度加大，進(jìn)入SW480 胞內(nèi)MPA 均增多(表1)。

3 討論

曾有研究報道藥物MPA 含量測定的方法［2］，本實驗建立了測定人低分化結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞內(nèi)、外液中MPA 含量的方法，實驗結(jié)果證明該法特異性強(qiáng)、線性關(guān)系良好、精密度、回收率和穩(wěn)定性都較好，為MPA 用于藥代學(xué)、蛋白組學(xué)和細(xì)胞凋亡周期等研究提供了輔助手段。本研究證實孵育時間和給藥濃度等因素與胞內(nèi)MPA 濃度呈正相關(guān)，而不同濃度MPA 對結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞增殖具有一定抑制或誘導(dǎo)凋亡作用。這一結(jié)果吻合本實驗前期MPA 誘導(dǎo)SW480 細(xì)胞凋亡、抑制增殖率具有劑量依賴性和時效相關(guān)性的研究［3］。課題所提供的RT-HPLC 實驗方法學(xué)為抗腫瘤藥物細(xì)胞濃度監(jiān)測、藥動學(xué)、基因藥理學(xué)等多領(lǐng)域相關(guān)研究提供技術(shù)參考范例。

表1 加藥培養(yǎng)組SW480 細(xì)胞內(nèi)、外液MPA 含量測定Table 1 Determination of intracellular and outracellar of MPA in SW480(μmol/L，n=10)

［1］KurbayashiJ，Yamamoto S，Otsuki T，et al.Medroxyprogesterone acetate inhibits interleukin6 secretion from KPL-4 human breast cancer cell both in uitro and in uiuo:a possible mechanism of the anticachec-tic effect［J］.Br J Cancer，1999，79:631-636.

［2］趙純玉，周文杰，文麗.高效液相色譜法測定醋酸甲羥孕酮片的含量［J］.中國藥業(yè)，2009，18:32-33.

［3］張瑜，邱宗蔭.醋酸甲羥孕酮誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞凋亡及其差異表達(dá)蛋白的分析［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2010，12:77-83.