胡 深，張洪義

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 空軍臨床學(xué)院， 安徽 合肥 230023； 2.中國人民解放軍空軍總醫(yī)院 肝膽外科，北京 100142)

1962年首先發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激下果蠅幼蟲的唾液腺出現(xiàn)染色體膨突，之后膨突編碼的基因和蛋白質(zhì)得到證實為應(yīng)激蛋白[1]。細(xì)胞能生存與熱應(yīng)激蛋白的表達(dá)和積累密切相關(guān)，特別是應(yīng)激蛋白基因表達(dá)的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein/ immunoglobulin binding protein,GRP78/Bip)。最近10年內(nèi)，有關(guān)GRP78/Bip的研究以氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、創(chuàng)傷應(yīng)激以及藥物和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏應(yīng)激居多。肝臟是機(jī)體物質(zhì)新陳代謝的生化工廠，這就決定了它易受到不同應(yīng)激原的刺激。在應(yīng)對有害刺激、保護(hù)肝臟組織中，GRP78/Bip的作用備受重視。

1 GRP78/Bip的概述

1.1 GRP78/Bip的來源

GRP78/Bip屬于應(yīng)激蛋白家族，是龐大的糖蛋白超基因家族中較為保守的一員。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激蛋白家族包括至少8個獨特的基因產(chǎn)物，即Hsp70- 1a、Hsp70- 1b、 Hsp70- 1t、Hsp70- 2、GRP78/Bip、Hsp70- 6、Hsc70和Hsp70- 9(也被稱為Grp75或mtHsp73或Mortalin)。它們從氨基酸序列、表達(dá)水平到亞細(xì)胞定位都不盡相同。其中GRP78/Bip和GRP75/Mortalin的定位分別限于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔和線粒體基質(zhì)，而其余6種應(yīng)激蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，這表明它們抑或?qū)ο鄳?yīng)的受體蛋白顯示出特異性抑或具有表達(dá)獨立伴侶的特定功能。

1.2 GRP78/Bip的結(jié)構(gòu)

GRP78/Bip的結(jié)構(gòu)具有保守性。眾所周知，應(yīng)激蛋白都具有高度保守的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域，包括：1)一個保守的ATP酶結(jié)構(gòu)域；2)蛋白酶結(jié)合點的中間區(qū)域; 3)肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域; 4)一個富含G/P并擁有一個特殊結(jié)構(gòu)C-端區(qū)域，它可結(jié)合其伴侶蛋白或者其他應(yīng)激蛋白。GRP78/Bip包含一個假定的N-末端定位信號，引導(dǎo)其定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，在其遠(yuǎn)端的C末端，它有一個高度保守的相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號，該信號對可溶性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)局部化的蛋白質(zhì)是常見的。

1.3 GRP78/Bip的功能

結(jié)構(gòu)決定功能，GRP78/Bip的功能同樣具有保守性。這些功能與應(yīng)激時細(xì)胞保護(hù)密切相關(guān)。業(yè)已證實，GRP78/Bip具有分子伴侶功能主要包括細(xì)胞間蛋白的傳導(dǎo)、降解不穩(wěn)定和錯誤折疊的蛋白、預(yù)防和溶解蛋白質(zhì)復(fù)合物、蛋白質(zhì)折疊和復(fù)性、網(wǎng)格蛋白小泡的脫殼以及控制調(diào)節(jié)性蛋白[2]。最新研究發(fā)現(xiàn)，GRP78/Bip過表達(dá)對高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠起到保護(hù)作用[3]。誘導(dǎo)型GRP78/Bip通過提高細(xì)胞膜的蛋白轉(zhuǎn)運功能以減少細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，達(dá)到抑制鈣超載的目的[4]。GRP78/Bip的異常表達(dá)與遺傳性疾病Marinesco-Sj?gren綜合征(常染色體顯性多囊肝)、Wolcott-Rallison綜合征和多種癌癥等疾病有關(guān)；同時對于非酒精性脂肪肝的發(fā)生，GRP78/Bip 也可能起著關(guān)鍵作用[5]。在毒理學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)，尼古丁可誘導(dǎo)人胎盤絨毛癌細(xì)胞內(nèi)的GRP78/Bip蛋白表達(dá)[6]，類似的現(xiàn)象也發(fā)生在過氧化氫對肝癌細(xì)胞的作用[7]。

2 GRP78/Bip與肝臟應(yīng)激損傷

對肝細(xì)胞應(yīng)激損傷的研究主要從經(jīng)典的熱應(yīng)激(heat stress,HS)、共通的氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)和分子水平的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endo-plasmic reticulum stress,ERS)出發(fā)，予以綜述。

2.1 GRP78/Bip與肝臟熱應(yīng)激

HS是由熱刺激導(dǎo)致的肝臟保護(hù)性反應(yīng)。大量研究表明，動物的熱應(yīng)激與GRP78/Bip的表達(dá)密切相關(guān)，因為GRP78/Bib是具有代表性的分子伴侶蛋白[8]。肝臟在熱應(yīng)激作用下可誘導(dǎo)GRP78/Bip的表達(dá)，輕度熱應(yīng)激，產(chǎn)生適應(yīng)性保護(hù)作用，以應(yīng)對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；而高熱抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，增強(qiáng)肝細(xì)胞中的應(yīng)激蛋白的表達(dá)[9]。

2.2 GRP78/Bip與肝臟氧化應(yīng)激

肝臟氧化應(yīng)激是肝細(xì)胞損傷的可能機(jī)制之一。有氧代謝的生理過程中，通過線粒體呼吸鏈代謝復(fù)合體產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)自由基，而細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS可以導(dǎo)致細(xì)胞OS狀態(tài)，肝臟細(xì)胞內(nèi)含有豐富的線粒體，當(dāng)出現(xiàn)OS時，就先受到嚴(yán)重?fù)p傷。對于嚴(yán)重缺氧或氧化應(yīng)激，GRP78/Bip在體內(nèi)過表達(dá)可以減少活性氧ROS，這對細(xì)胞生存也至關(guān)重要[10]。研究表明，肝病的共同發(fā)病機(jī)制可能與OS有關(guān)[11]。肝細(xì)胞中蛋白質(zhì)羰基化是蛋白質(zhì)/氨基酸修飾后的產(chǎn)物，氧化應(yīng)激后蛋白質(zhì)羰基的發(fā)生率較高，以此作為一個有效的檢測標(biāo)志物[12]，但羰基化是不可逆轉(zhuǎn)的。因此，含有羰基的蛋白質(zhì)，在維持細(xì)胞蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)時須有退化的蛋白酶體[13]。

據(jù)研究，分子伴侶是不會被氧化的蛋白，而是被泛素化修飾后的蛋白。作為分子伴侶蛋白，GRP78/Bip也同樣具備可泛素化。GRP78/Bip增加內(nèi)源性超氧化物歧化酶(super oxide dismutase, SOD)水平，所以在保護(hù)肝細(xì)胞正常生理代謝中有間接作用。輕度應(yīng)激如發(fā)熱溫度，產(chǎn)生適應(yīng)性保護(hù)作用，以應(yīng)對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]。在氧化應(yīng)激期間，溶酶體鐵對氧化誘導(dǎo)細(xì)胞死亡起到主要決定因素。以往研究，通過對幾個關(guān)鍵蛋白從基因調(diào)控表達(dá)轉(zhuǎn)錄和翻譯上，認(rèn)為氧化應(yīng)激是細(xì)胞適應(yīng)性自我保護(hù)。但現(xiàn)在有觀點認(rèn)為細(xì)胞氧化應(yīng)激最初機(jī)制是快速清除氧化受損的細(xì)胞蛋白[15]。氧化應(yīng)激可能是在急性酒精誘導(dǎo)肝損傷下能量抑制的一個潛在性的機(jī)制[16]。以上研究對于氧化應(yīng)激起到承前啟后的作用，進(jìn)一步基因水平的研究對氧化應(yīng)激的通路和信號傳導(dǎo)仍需學(xué)者們探討。

2.3 GRP78/Bib與肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是指肝細(xì)胞受到內(nèi)外因素刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)、功能的狀態(tài)受到破壞時細(xì)胞采取的一系列反應(yīng)狀態(tài)。GRP78/Bip位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，有利于新合成的蛋白質(zhì)的運輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，并隨后將其折疊[17]。HSPA5基因敲除的小鼠胚胎在胚胎3.5 d時死亡。因此，它被視為一個重要的管家基因[18]。

在肝細(xì)胞的胞質(zhì)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在應(yīng)激時，也會造成鈣穩(wěn)態(tài)失衡、蛋白質(zhì)修飾和運輸障礙，產(chǎn)生一種細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的狀態(tài)[19]。目前發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸異常代謝、氧化應(yīng)激和鈣代謝紊亂等都能誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在這個過程中，可能產(chǎn)生一種未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)，這種反應(yīng)會影響蛋白質(zhì)合成，反應(yīng)強(qiáng)烈時甚至?xí)T導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。對于UPR的通路研究，目前發(fā)現(xiàn)未折疊蛋白反應(yīng)的3支(IRE1, PERK和ATF6)通路，因通過減少未折疊蛋白的水平，增強(qiáng)細(xì)胞生存能力，其中IRE1信號對細(xì)胞的命運起著關(guān)鍵作用[21]。肝細(xì)胞內(nèi)某些酶或物質(zhì)缺失，比如胱硫醚β合成酶和(或)甲基供體缺乏癥都會引起細(xì)胞氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而造成肝臟損傷，引發(fā)肝病發(fā)生[22]。在肝臟應(yīng)激中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是一個新興的課題，國外學(xué)者正在積極投入研究，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對肝細(xì)胞凋亡和腫瘤形成都密切相關(guān)，但其具體機(jī)制和調(diào)控仍需深入研究[23]。

3 展望

當(dāng)今對應(yīng)激蛋白研究已經(jīng)在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控方面有了突出的進(jìn)展，同時伴隨的還有免疫和腫瘤方面突破性研究，但這都未能確切的闡釋其具體的關(guān)聯(lián)和調(diào)控機(jī)制，對此還需要更多的實驗證明[24]。

而作為經(jīng)典的內(nèi)源性保護(hù)蛋白GRP78/Bip，在生物學(xué)功能上有其獨特的臨床應(yīng)用價值。對GRP78/Bip在分子生物、生化以及基因信息傳遞方面深入的研究，尤其以肝細(xì)胞應(yīng)激中的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激為理論基礎(chǔ)研究，將給應(yīng)激蛋白家族應(yīng)用于臨床肝膽病，發(fā)現(xiàn)病因和病理機(jī)制提供全新的一頁。

[1] Ritossa F. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila[J]. Experientia, 1962, 18: 571- 573.

[2] Meimaridou E，Gooljar SB，Chapple JP.From hatching to dispatching：the multiple cellular roles of the Hsp70 molecular chaperone machinery [J].J Mol Endocfinol，2009,42:1- 9.

[3] Teodoro-Morrison T, Schuiki I, Zhang L,etal. GRP78 overproduction in pancreatic beta cells protects against high-fat-diet-induced diabetes in mice[J]. Diabetologia, 2013: 1- 11.

[4] Guo S, Wharton W，Meseley P，et a1.Heat shock protein 70 regalates cellular redox status by modulating glutathione-related enzyme activities [J].Cell Stress Chaperones,2007,12：245- 254.

[5] Gawrieh S, Baye T M, Carless M,etal. Hepatic gene networks in morbidly obese patients with nonalcoholic fatty liver disease[J]. Obes Surg, 2010, 20: 1698- 1709.

[6] K Repo J, Pesonen M, Mannelli C,etal. Exposure to ethanol and nicotine induces stress responses in human placental BeWo cells[J]. Toxicol Lett, 2014, 224: 264- 271.

[7] Tang W, Wang L, Wang Y,etal. Peroxisome proliferator-activated receptor-α activation protects against endoplasmic reticulum stress-induced HepG2 cell apoptosis[J]. Mol Cell Biochem, 2014, 385: 179- 190.

[8] Taras Makhnevych, Walid A. Houry The control of spindle length by Hsp70 and Hsp110 molecular chaperones[J].FEBS Lett, 2013,587:1067- 1072.

[9] Pallepati P, Diana A, Bates A.Mild thermotolerance induced at 40℃ protects HeLa cells against activation of death receptor-mediated apoptosis by hydrogen peroxide[J].Free Radic Biol Med, 2011,50:667- 679.

[10] Priti A, Julie R, Gabriel G,etal. Distinct role of Hsp70 in Drosophila hemocytes during severe hypoxia[J].Free Radic Biol Med, 2011,51:530- 538.

[11] Muriel P.Role of free radicals in liver diseases[J].Hepatology,2009,3：526- 536.

[12] Irazusta, V, Moreno-Cermeno, A, Cabiscol E,etal. Proteomic strategies for the analysis of carbonyl groups on proteins[J].Curr Protein Pept Sci, 2010,11:652- 658.

[13] Shang, F, Taylor A. Ubiquitin-proteasome pathway and cellular responses to oxidative stress[J]. Free Radic Biol Med,2011,51:5- 16.

[14] Pragathi Pallepati, Diana A. Averill-Bates.Mild thermotolerance induced at 40℃ protects HeLa cells against activation of death receptor-mediated apoptosis by hydrogen peroxide[J]. Free Radic Biol Med, 2011,50:667- 679.

[15] Pickering, A.M, Koop, A.L, Teoh, C.Y,etal.The immunoproteasome, the 20S proteasome and the PA28alphabeta proteasome regulator are oxidative-stress-adaptive proteolytic complexes[J]. Biochem J,2010, 432:585- 594.

[16] Dusan M, Milica N, Vuk A,etal. The effect of calorie restriction on acute ethanol-induced oxidative and nitrosative liver injury in rats[J].Environ Toxicol Pharmacol, 2013, 36:296- 302.

[17] Gething, M.J. Role and regulation of the ER chaperone BiP[J]. Semin Cell Dev Biol, 1999, 10: 465- 472.

[18] Luo S, Mao C, Lee B,etal. GRP78/BiP is required for cell proliferation and protecting the inner cell mass from apoptosis during early mouse embryonic development[J]. Mol Cell Biol, 2006, 26: 5688- 5697.

[19] Rutkowski DT.Kaufman RJ.A trip to the ER：coping with stress[J].Trends Cell Biol,2004,14:20- 28.

[20] Schr?der M. Endoplasmic reticulum stress responses[J]. Cell Mol Life Sci, 2008, 65: 862- 894.

[21] Lin JH, Li H, Yasumura D,etal.IRE1 signaling affects cell fate during the unfolded protein response[J]. Science,2007, 318: 944- 949.

[22] Shabnam P, Sébastien B, Maira M G,etal. Methyl donor deficiency impairs fatty acid oxidation through PGC- 1a hypomethylation and decreased ER-a, ERR-a, and HNF-4a in the rat liver[J].J Hepatol, 2012,57: 344- 351.

[23] Tom V, Abhishek D G, Patrizia A. Targeting ER stress induced apoptosis and inflammation in cancer[J].Cancer Lett,2013, 332:249- 264.

[24] Silver J T, Noble E G. Regulation of survival gene hsp70[J]. Cell Stress and Chaperones, 2012, 17: 1- 9.