王衛(wèi)娜，栗 亮，范小琴，高 原*

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生理學(xué)教研室，廣東珠海519090;2.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校生理學(xué)教研室，河南南陽(yáng)473000;3.棗莊職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，山東棗莊277800)

糖尿病腎病是1 型和2 型糖尿病的主要慢性并發(fā)癥之一，糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展中氧化應(yīng)激等多種因素起重要作用。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose protein 2，GLUT2)受到人們的重視，也是因?yàn)樗赡茉谔悄虿∧I病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［1］。本實(shí)驗(yàn)探討GLUT2 在實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠早期腎臟中的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及動(dòng)物與分組:清潔級(jí)雄性SD 大鼠:清潔級(jí)，體質(zhì)量(200 ±15)g，中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)SCXK(粵)2007-0011，隨機(jī)分為對(duì)照組和常規(guī)復(fù)制糖尿病模型。材料:STZ(Sigma 公司)，兔抗大鼠GLUT2 多克隆抗體(ABSUN 公司)，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，Mouse anti.ACTIN 單克隆抗體(PTGLAB公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腎小管刷狀緣膜(BBMV)的制備:在1、2、4、6 周末處死動(dòng)物取腎，用4 ℃的0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈，取其皮質(zhì)，稱(chēng)重后剪碎;按照重量加入稀釋液1，倒入手動(dòng)勻漿器并加入蛋白酶抑制劑后勻漿;加入1 mol/L MgCl2，使其終濃度為10 mmol/L?；靹蚝? ℃放置20 min。在4 ℃2 500 ×g離心30 min，取上清液;在4 ℃16 500 ×g 離心60 min保留沉淀，用介質(zhì)2 充分懸浮后在4 ℃16 500 ×g 離心60 min;保留沉淀，即為腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣膜，凍存于－80 ℃深低溫冰箱，用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度保證上樣濃度的一致性。

1.2.2 腎臟GLUT2 表達(dá)的檢測(cè):分別以免疫組化和Western blot 法檢測(cè)GLUT2 蛋白，實(shí)驗(yàn)過(guò)程按說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。相關(guān)性行直線相關(guān)回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠早期腎臟GLUT2 的免疫組化染色:與對(duì)照組相比，模型組腎小管GLUT2 蛋白量明顯增高，4 周時(shí)增高更顯著(P＜0.05)(圖1，表1)。

2.2 Western blot 檢測(cè)GLUT2 蛋白表達(dá):與對(duì)照組相比，模型組GLUT2 蛋白含量明顯升高(P＜0.05)，4 周組GLUT2 表達(dá)量增加更顯著(P＜0.05)(圖2，表1)。

表1 各組GLUT2 的免疫組化及Western blot平均吸光度Table 1 The absorbance value of Immunohistochemistry and Western blot in brush-border membrane vesicles GLUT2 protein content in each group(±s，A，n=10)

表1 各組GLUT2 的免疫組化及Western blot平均吸光度Table 1 The absorbance value of Immunohistochemistry and Western blot in brush-border membrane vesicles GLUT2 protein content in each group(±s，A，n=10)

*P＜0.05 compared with control;#P＜0.05 compared with 4 weeks group.

groupWestern blotimmunohistochemistry control0.42 ±0.160.21 ±0.10 model1 week0.75 ±0.11* #0.37 ±0.03* #2 weeks0.79 ±0.03* #0.42 ±0.01* #4 weeks1.20 ±0.01*0.63 ±0.04*6 weeks0.81 ±0.12* #0.45 ±0.02*#

2.3 糖尿病大鼠GLUT2 與血胰島素、血糖相關(guān)性分析:糖尿病大鼠4 周時(shí)GLUT2 吸光度值與血糖成正相關(guān)(P＜0.05)，與胰島素值成負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。

3 討論

圖1 糖尿病大鼠早期腎臟GLUT2 的免疫組化染色變化Fig 1 Immunohistochemistry stain in control group and diabetic model groups (×200)

圖2 Western blot 測(cè)定各組GLUT2 蛋白Fig 2 Identification of GLUT2 protein and anti-action by Western blot

糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，腎臟高功能是糖尿病腎損害早期腎臟進(jìn)行性功能代償?shù)谋憩F(xiàn)。表現(xiàn)GLUT2 蛋白的增高。至于它的這種變化是否與以上的因素存在著因果關(guān)系，或者說(shuō)是由于它們的變化引起的，還有待于進(jìn)一步的研究。有細(xì)胞膜上與物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的一些重要的功能蛋白表達(dá)增強(qiáng)，活性增加［2-3］，那么在糖尿病背景下，腎小管高功能的代償過(guò)程中GLUT2 表達(dá)如何變化。本研究發(fā)現(xiàn)GLUT2蛋白的表達(dá)增加且具有一定的規(guī)律，另外糖尿病大鼠血肌酐、血壓、腎比重升高，這些和前人研究共同說(shuō)明了糖尿病早期的代償表現(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)觀察到大鼠糖尿病早期腎小管GLUT2 蛋白含量的高表達(dá)可能和血糖以及血胰島素的變化有關(guān)。糖尿病大鼠葡萄糖的重吸收增高，而且葡萄糖重吸收增高也伴隨著

［1］Király MA，Bates HE，Kaniuk NA.Swim training prevents hyperglycemia in ZDF rats:mechanisms involved in the partial maintenance of beta-cell function［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2008:271-283.

［2］Hassan Rahmoune，Paul W.Thompson Glucose.Transporters in human renal proximal tubular cells isolated from the urine of patients with non-insulin-dependent diabetes［J］.Diabetes，2005:3427-3434.

［3］Lehnen AM1，Leguisamo NM，Dias LD.Changes in renal glucose transporters in an animal model of metabolic syndrome［J］.Horm Metab Res，2013，45:840-843.