李少華，邱 玲，程歆琦，李 霽，杜順達(dá)，毛一雷

(1.中山大學(xué)腫瘤防治中心肝膽科華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室腫瘤醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東廣州510060;中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院2.肝臟外科;3.檢驗(yàn)科;4.病理科，北京100733)

在中國患肝炎病后，肝纖維化、硬化、肝癌高發(fā)［1］。建立肝纖維化動(dòng)物模型，有利于進(jìn)行病理過程的研究。四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)導(dǎo)致肝微粒體脂質(zhì)過氧化，肝脂肪變性、進(jìn)而纖維化。常規(guī)采用高濃度CCl4建模型，對(duì)動(dòng)物選擇性強(qiáng)，同時(shí)因給藥劑量高，動(dòng)物死亡率高。本實(shí)驗(yàn)采用低濃度CCl4、反復(fù)腹腔注射，希望建立一套簡(jiǎn)便可行的小鼠肝纖維化建模方法。

1 材料與方法

1.1 材料:SPF 級(jí)6～7 周齡雌性昆明小鼠42 只，體質(zhì)量19～25 g［北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司:SCXK(京)2001-0011］。10% CCl4油溶液(分析純CCl4∶大豆油=1∶9)。

1.2 方法:小鼠分籠飼養(yǎng)于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，適應(yīng)1 周。小鼠隨機(jī)分成3 組:對(duì)照組(n=10):每48 h 腹腔注射0.4 mL 0.9%氯化鈉注射液;正常組(n=5):正常飼養(yǎng);肝纖維化組(n=27):每48 h 腹腔注射0.4 mL 10% CCl4油溶液。共42 d。

觀察小鼠進(jìn)食、活動(dòng)和存活等情況;每6 天測(cè)量體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)42 d 眼眶取血，檢驗(yàn)血清學(xué)指標(biāo):總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、血葡萄糖(glucose，Glu)、血鈉離子(natrium，Na)等。之后開腹觀察腹腔、肝臟;取全肝予甲醛固定，切片染色后鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 一般情況:3 組小鼠進(jìn)食相似。肝纖維化組在實(shí)驗(yàn)第2周時(shí)較活躍，第4 周開始出現(xiàn)腹部脹大、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍，42 d 可見腹部明顯膨隆，活動(dòng)遲緩。各組小鼠體質(zhì)量隨實(shí)驗(yàn)天數(shù)增加而增加，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

纖維化組小鼠共死亡7 只(25.9%):實(shí)驗(yàn)第2 天4 只，尸檢無明顯異常;第16、18 天各1 只，腹腔內(nèi)少量腹水;第38天1 只，腹腔大量淡黃色腹水，肝表面小結(jié)節(jié)增生，并覆乳白色纖維條索。

2.2 血清指標(biāo):肝纖維化組小鼠血清TP、ALB、ALP、Glu 和Na 等均顯著異常(表1)。

2.3 肝臟病理:肝纖維化組20 只小鼠腹腔內(nèi)均有淡黃色腹水;肝臟深紅色、表面明顯小結(jié)節(jié)增生，覆大量乳白色、淡粉色纖維條索，質(zhì)地稍硬。低倍鏡下見小葉周邊界板區(qū)壞死，大量纖維膠原組織增生;高倍鏡下見小葉周邊纖維組織增生(圖1)。

3 討論

目前常用的肝纖維化建模方法包括毒物刺激、物理作用、飲食控制等，各有優(yōu)缺點(diǎn)［2］。腹腔注射高濃度CCl4多應(yīng)用于大動(dòng)物，且病死率高。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射低濃度CCl4，成功建立了小鼠肝纖維化模型。

表1 所有小鼠血清學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 The serum examination results of mice in all groups

圖1 肝纖維化小鼠的肝臟病理結(jié)果Fig 1 The liver pathology of fibrosis mice with HE stain

從一般情況看，肝纖維化組小鼠中后期體質(zhì)量增加明顯，可能是腹水導(dǎo)致體質(zhì)量增加。相應(yīng)的，隨著腹水形成，小鼠腹部膨隆，活動(dòng)減少、遲緩。

在纖維化組，TP 和ALB 顯著降低，提示肝臟的合成功能受到了損害;ALP 升高，可能為肝細(xì)胞受損、微膽管梗阻所致;血糖的升高，考慮是肝臟受損后無法將血糖迅速轉(zhuǎn)化為糖原［3］。肝硬化時(shí)，因肝功能受損，血中鈉離子水平降低，在肝纖維化組觀察到了血鈉的降低。這些血清學(xué)指標(biāo)的變化，反應(yīng)了肝臟合成和分泌功能受到了影響，從功能上顯示了建立肝纖維化模型的成功性。當(dāng)然，最終明確建模的成功，還需要從結(jié)構(gòu)上證實(shí)。

大體上看，肝纖維化組小鼠腹腔大量淡黃色腹水，肝臟顏色深、表面小結(jié)節(jié)增生，覆蓋大量纖維條索狀物，質(zhì)地較硬。鏡檢顯示可見界板區(qū)壞死及纖維組織增生。病理檢查從結(jié)構(gòu)上證實(shí)了肝纖維化模型的成功建立。

結(jié)合本組前期實(shí)驗(yàn)［4］，選取42 d 為終點(diǎn)，從結(jié)果看存活小鼠100%出現(xiàn)肝纖維化，保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可靠性。實(shí)驗(yàn)中小鼠病死率為25.9%，相對(duì)較低，保證了實(shí)驗(yàn)效率。

通過腹腔注射低濃度CCl4油溶液，操作簡(jiǎn)便，并且對(duì)小鼠是安全的，從結(jié)構(gòu)和功能上均提示能夠成功的建立肝纖維化模型。

［1］徐海峰，楊華瑜，張宏冰，等.改變肝癌早期診斷和治療現(xiàn)狀的新肝癌血清標(biāo)志物［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，28:104-108.

［2］曾燕，趙建農(nóng)，冷志，等.不同濃度四氯化碳復(fù)合法誘導(dǎo)家兔肝纖維化模型的建立［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31:694-697.

［3］毛一雷，杜順達(dá).進(jìn)一步完善原發(fā)性肝癌的術(shù)前評(píng)估體系［J］.中華外科雜志.2010，48:1530-1533.

［4］毛一雷，董一女，張現(xiàn)忠，等.99mTc-DTPA-半乳糖人血清白蛋白在不同小鼠肝損傷模型中肝功能顯像的應(yīng)用［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，4:404-408.