黃 煒，徐 玲，徐 勇，周雪琴，彭 娟

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川瀘州646000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病特有而常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制不清。研究表明，以單核-巨噬細(xì)胞激活為特征的慢性亞臨床炎性反應(yīng)貫穿于DN 發(fā)生發(fā)展始終，腎小球系膜細(xì)胞在此病理過(guò)程中扮演著重要角色［1］。

核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)是目前公認(rèn)的介導(dǎo)炎性反應(yīng)的主要信號(hào)通路。IκBα 的磷酸化、繼而泛素化降解是NF-κB 信號(hào)激活的關(guān)鍵步驟［2］。SUMO 化修飾是與泛素化類似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式，最近的研究顯示，SUMO 化修飾也參與了對(duì)NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)［3］。SUMO 化修飾能否通過(guò)影響IκBα 的泛素化降解、激活，NF-κB 信號(hào)參與DN 的發(fā)病尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究觀察高糖刺激后大鼠腎系膜細(xì)胞SUMO 蛋白與IκBα 蛋白的相互作用，以及IκBα、NF-κB P65 的表達(dá)，旨在探討SUMO 化修飾在DN 發(fā)病中的作用，為DN 的防治提供新理論。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心);兔抗大鼠SUMO1 單克隆抗體(Abcam 公司);兔抗大鼠SUMO2/3 多克隆抗體(Millipore 公司);小鼠抗大鼠IκBα 單克隆抗體和兔抗大鼠、NF-κB P65 單克隆抗體(Cell Signaling Technology 公司)和兔抗大鼠α-Tubulin 單克隆抗體(Abcam 公司)，小鼠抗大鼠GAPDH 抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司)，免疫共沉淀(Co-IP)試劑盒(Pierce 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組:HBZY-1 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的低糖DMEM 中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分設(shè)1)對(duì)照組(NC 組):低糖(含葡萄糖5.6 mmol/L)培養(yǎng)基;2)高糖干預(yù)組(HG1、HG2 和HG3 組):培養(yǎng)基分別含葡萄糖10、20 和30 mmol/L;3)滲透壓對(duì)照組(OP 組):培養(yǎng)基含5.6 mmol/L 葡萄糖和24.4 mmol/L 甘露醇;4)MG132 干預(yù)組:培養(yǎng)基含30 mmol/L 葡萄糖和1 μmol/L MG132;分別作用6、12、24、48 和72 h 后收獲細(xì)胞。

1.2.2 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation):將細(xì)胞隨機(jī)分為:對(duì)照組(NC)、20 mmol/L 高糖組(HG2)、滲透壓對(duì)照組(OP)、正常IgG 陰性對(duì)照組(IgG)，分別在含上述不同干預(yù)因素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。按試劑盒要求加入含蛋白酶體抑制劑的IP 裂解液，定量加入小鼠抗大鼠IκBα 單克隆抗體(NC、HG2 和OP 組)和正常大鼠IgG 抗體(IgG 組)，4 ℃輪轉(zhuǎn)搖晃充分孵育。將蛋白-抗體復(fù)合物移入離心柱取并加入含蛋白A/G 瓊脂糖，密封輪轉(zhuǎn)孵育1 h;離心洗脫瓊脂糖，將免疫沉淀產(chǎn)物煮沸變性后行免疫印跡(Western blot)分析，用兔抗大鼠SUMO1 單克隆抗體(1∶800)，兔抗大鼠SUMO2/3 多克隆抗體(1∶600)一抗孵育檢測(cè)SUMO 蛋白與IκBα 蛋白間相互作用。

1.2.3 免疫印跡(Western blot)法:取細(xì)胞加蛋白抽提液，加樣品電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別在相應(yīng)分子量的PVDF 膜上孵育小鼠抗大鼠IκBα 單克隆抗體(1∶1 000)，兔抗大鼠、NF-κB P65 單克隆抗體(1∶1 000)，小鼠抗大鼠GAPDH 單克隆內(nèi)參抗體(1∶2 000)，兔抗大鼠 α-Tubulin 單克隆抗體(1∶3 000)，4 ℃過(guò)夜，PBST 洗膜后分別用HRP 標(biāo)記的二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯影。以IκBα、NF-κB P65蛋白與內(nèi)參GAPDH，α-Tubulin 蛋白條帶平均吸光度值之比表示IκBα、NF-κB P65 蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用q 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 高糖特異性減弱腎系膜細(xì)胞IκBα 的SUMO化修飾

20 mmol/L 高糖(HG2)組在約60 ku 處出現(xiàn)SUMO1-IκBα 結(jié)合條帶(圖1A)及SUMO2/3-IκBα 結(jié)合條帶(圖1C)，同時(shí)，IgG 對(duì)照組在相應(yīng)蛋白分子位置未顯現(xiàn)蛋白條帶。與NC 組比較，HG2 組與OP 組SUMO1-IκBα 結(jié)合蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.05)(圖1B);與NC 組及OP 組比較，HG2 組SUMO2/3-IκBα結(jié)合蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.05，圖1D)。

2.2 高糖促進(jìn)腎系膜細(xì)胞IκBα 降解

與NC 組比較，隨高糖作用時(shí)間延長(zhǎng)，各組系膜細(xì)胞IκBα 蛋白表達(dá)均減弱(P＜0.05)(圖2A);其中30 mmol/L 葡萄糖作用72 h 后系膜細(xì)胞IκBα 蛋白表達(dá)最弱。不同濃度高糖干預(yù)系膜細(xì)胞24 h 后，與NC 組與OP 組比較，IκBα 蛋白表達(dá)量隨糖濃度增加而降低(P＜0.05)(圖2B)。加入蛋白酶體抑制劑MG132 后，高糖介導(dǎo)的IκBα 泛素化降解被部分逆轉(zhuǎn)(P＜0.05)(圖2C)。

圖1 免疫共沉淀檢測(cè)腎系膜細(xì)胞IκBα SUMO 化修飾Fig 1 IκBα is sumoylated by SUMO was detected by Co-immunoprecipitation (Co-IP)

2.3 高糖激活、NF-κB

與NC 組比較，高糖干預(yù)24 h 后，隨糖濃度提高，NF-κB P65 蛋白表達(dá)逐步增加(P＜0.05)(圖3)。

3 討論

糖尿病既是以高血糖為特征的代謝性疾病，也是一種全身性、慢性低度炎性反應(yīng)疾病［4］。NF-κB信號(hào)是介導(dǎo)炎性反應(yīng)最主要的通路，IκBα 的泛素化降解活化NF-κB 轉(zhuǎn)位入核，是NF-κB 信號(hào)經(jīng)典途徑激活的必要條件。本研究中發(fā)現(xiàn):高糖呈濃度/時(shí)間依賴性地減弱腎系膜細(xì)胞IκBα 蛋白表達(dá)，蛋白酶體抑制劑MG132 可以部分反轉(zhuǎn)高糖介導(dǎo)的IκBα 泛素化降解，同時(shí)高糖又呈濃度依賴性地增強(qiáng)NF-κB P65 蛋白的表達(dá)。因此，結(jié)合文獻(xiàn)，推測(cè)高糖可以通過(guò)激活泛素-蛋白酶體途徑降解IκBα 蛋白，激活NF-κB 信號(hào)，參與腎臟慢性炎性反應(yīng)病變的發(fā)生［5］。

鑒于NF-κB 信號(hào)在DN 發(fā)病中起重要作用，阻斷高糖介導(dǎo)的NF-κB 信號(hào)活化，成為防治DN 的重要課題。研究顯示，使用泛素-蛋白酶體抑制劑MG132 等不能完全阻斷DN 時(shí)NF-κB 信號(hào)通路的活化，這表明蛋白的其他修飾途經(jīng)可能也參與了這條通路的激活［6-7］。

圖2 Western blot 檢測(cè)不同時(shí)間/濃度高糖及MG132 作用后IκBα 表達(dá)Fig 2 Western blot detected the expression of IκBα after various glucose concentrations and times high glucose challenge and MG132

與泛素化介導(dǎo)的蛋白降解不同，SUMO 化修飾是通過(guò)蛋白-蛋白相互作用而賦予靶蛋白新的生物特性，從多種層面動(dòng)態(tài)地影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，可能參與多種疾病的病理生理改變。目前已發(fā)現(xiàn)SUMO 存在4 個(gè)亞型，SUMO2與SUMO3 氨基酸序列非常接近，常合寫(xiě)成SUMO2/3。不同亞型SUMO 蛋白在組織分布和細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的定位不同，其功能也不盡相同:SUMO1 在生理狀態(tài)下參與蛋白修飾;SUMO2/3 則主要修飾應(yīng)激蛋白，參與滲透壓、氧化應(yīng)激和DNA 損傷等介導(dǎo)的病理生理改變［8］。

IκBα 是在NF-κB 信號(hào)通路調(diào)節(jié)中被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)SUMO 修飾蛋白。IκBα 主要的SUMO 化位點(diǎn)是K21，該位點(diǎn)同時(shí)也是IκBα 發(fā)生泛素化修飾的位點(diǎn)［9］。有研究發(fā)現(xiàn)SUMO1 可修飾IκBα 對(duì)抗泛素化介導(dǎo)的NF-κB 信號(hào)激活，而SUMO-2/3 亦可與IκBα 共價(jià)結(jié)合促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的NF-κB 激活［10-11］。本研究證明，高糖可特異性誘導(dǎo)減弱SUMO2/3 與IκBα 的相互作用，與高滲透壓因素?zé)o關(guān)。類似研究證明，通過(guò)低氧-再給氧循環(huán)刺激腺苷信號(hào)，可以募集SUMO，增強(qiáng)IκBα SUMO 化修飾，阻滯其發(fā)生磷酸化和泛素化降解，進(jìn)而減弱NF-κB 的激活和NF-κB信號(hào)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄［12］。推測(cè)正常條件下，SUMO 可能競(jìng)爭(zhēng)性地占據(jù)IκBα 泛素化位點(diǎn)，抑制IκBα 的降解，抑制NF-κB 信號(hào)的過(guò)度激活;高糖刺激特異性地減弱了腎系膜細(xì)胞IκBα 的SUMO 化修飾，導(dǎo)致其泛素化降解增強(qiáng)，進(jìn)而放大NF-κB 信號(hào)參與腎臟炎性反應(yīng)。

圖3 不同濃度高糖作用后NF-κB P65 表達(dá)Fig 3 The expression of NF-κB P65 after various glucose concentrations challenge were detected by western-bolt(±s，n=3)

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了高糖刺激腎系膜細(xì)胞NF-κB信號(hào)活化的又一重要機(jī)制:即高糖可能通過(guò)特異性地減弱SUMO2/3 與IκBα 的相互作用，促進(jìn)IκBα泛素化降解并上調(diào)NF-κB P65 表達(dá)，活化NF-κB 信號(hào)。該機(jī)制可能參與了糖尿病腎病的發(fā)病。

［1］Duran-Salgado MB，Rubio-Guerra AF.Diabetic nephropathy and inflammation［J］.World J Diabetes.2014，5:393-398.

［2］Wada J，Makino H.Inflammation and the pathogenesis of diabetic nephropthy［J］.Clin Sci，2013，124:139-152.

［3］Shibata Y，Inoue J.A novel NF-kappaB regulatory mechanism targeting a polyubiquitin chain［J］.Seikagaku，2013，85:405-413.

［4］Vaarala O，Yki-Jarvinen H.Diabetes:Should we treat infection or inflammation to prevent T2DM?［J］.Nat Rev Endocrinol，2012，8:323-325.

［5］Xu ZZ1，Wang M，Wang YJ，.Effect of nitrotyrosine on renal expressions of NF-κB，MCP-1 and TGF-β1 in rats with diabetic nephropathy［J］.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2013，33:346-350.

［6］Wu CC，Sytwu HK，Lin YF.Cytokines in diabetic nephrop-athy［J］.Adv Clin Chem，2012，56:55-74.

［7］徐玲，馬紅艷，楊軍，等.高糖和泛素蛋白酶體抑制劑MG132 對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞IκBα 蛋白表達(dá)的影響［J］.中國(guó)糖尿病雜志，2009，17:447-448.

［8］Denuc A，Marfany G.SUMO and ubiquitin path converge［J］.Biochem Soc Trans，2010，38:34-39.

［9］Tashiro K，Pando MP，Kanegae Y，et al.Direct involvement of the ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9/Hus5 in the degradation of IkappaBalpha［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1997，94:7862-7867.

［10］Desterro JM，Rodriguez MS，Hay RT.SUMO-1 modification of IkappaB alpha inhibits NF-kappaB activation［J］.Mol Cell，1998，2:233-239.

［11］Culver C，Sundqvist A，Mudie S，et al.Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB［J］.Mol Cell Biol，2010，30:4901-4921.

［12］Liu Q，Khoury J，Colgan SP，et al.Adenosine signaling mediates SUMO-1 modification of IκB during hypoxia and reoxygenation［J］.J Biol Chem，2009，284:13686-13695.