康清杰，向 征*，彭旭東，王 強(qiáng)，湯為學(xué)

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.胃腸外科;2.實(shí)驗(yàn)研究中心，重慶400016)

Ca2+作為細(xì)胞中重要的第二信使，對(duì)細(xì)胞的增殖、遷移和基因表達(dá)等有重要作用，在細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中，Ca2+相關(guān)的胞內(nèi)信息傳遞會(huì)有不正常的活化現(xiàn)象，其在腫瘤細(xì)胞的增殖失控過程中發(fā)揮了重要作用［1］。胞膜蛋白鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1(calcium release-activated calcium channel modulator 1)是鈣庫(kù)調(diào)控鈣通道(store-operated calcium channels，SOCC)的重要組成蛋白，它通過與基質(zhì)相互作用分子1(Stromal interaction molecule 1，STIM1)相互作用，激活SOCC，引起細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流形成SOCE(store-operated Ca2+entry)，進(jìn)而調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)［2］。研究表明，ORAI1 介導(dǎo)的SOCE 在異常狀態(tài)時(shí)與機(jī)體的多種疾病相關(guān)，比如在肝癌中，ORAI1 通過調(diào)節(jié)SOCE 強(qiáng)度，參與肝癌細(xì)胞的增殖［3］。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于ORAI1 與腫瘤的關(guān)系研究較少。本研究擬通過探討ORAI1 在SW480 增殖中的作用及可能的機(jī)制，為結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和細(xì)胞系

人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)室提供);干擾人ORAI1 基因的重組慢病毒(shRNA:CGTGCACAATCTCAACTCG)和空載體慢病毒(shRNA:TTCTCCGAACGTGTCACGT)(上海紐恩生物科技有限公司);Trizol、RT-PCR 試劑盒、SYBY 熒光定量試劑盒(大連TaKaRa 寶生生物工程有限公司);鈣離子熒光探針Rhod-2AM(AAT Bioquest);毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)、Nifedipine(Sigma 公司);兔抗人ORAI1 多克隆抗體、鼠抗人β-action 單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 和羊抗鼠IgG(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);兔抗人ERK1/2、p-ERK1/2 多克隆抗體(Immunoway 公司);兔抗人CyclinD1 多克隆抗體(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞用含10%胎牛血清、5%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 分組及慢病毒轉(zhuǎn)染:實(shí)驗(yàn)設(shè)干擾組、空病毒組和對(duì)照組。取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞成1 ×109個(gè)/L，鋪6 孔板(每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔)，每孔鋪2 ×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，以感染復(fù)數(shù)(MOI)20加入ORAI1 干擾慢病毒和空載體慢病毒，每孔液體總?cè)萘勘３衷?mL，再每孔加入5 μg 轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑凝聚胺(Polybrene)，24 h 后換夜，72 h 后用熒光顯微鏡攝像。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)細(xì)胞ORAI1 mRNA表達(dá):細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)72 h 后，按說(shuō)明書用Trizol 法抽提各組RNA、反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再用SYBY 熒光定量試劑盒進(jìn)行PCR 實(shí)時(shí)擴(kuò)增，反應(yīng)在CFX 96 型熒光定量PCR 儀上進(jìn)行，條件:預(yù)變性95 ℃30 s，然后95 ℃5 s，60 ℃30 s，反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)，結(jié)果以2－△△Ct值表示待測(cè)樣本基因表達(dá)量相對(duì)于校準(zhǔn)樣本基因表達(dá)量的倍數(shù)。ORAI1 引物由TaKaRa 寶生生物工程有限公司合成，序列如下:上游引物:5'-GCTG CTCTGCTGGGTCAAGTT-3'，下游引物:5'-CGATAAAG ATCAGGCCGAAGG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)179 bp;GAPDH上游引物:5'-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3'，下游引物:5'-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)132 bp，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞ORAI1 蛋白表達(dá):細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)72 h 后，分別收集各組細(xì)胞，加RIPA裂解液(含1%苯甲基磺酰氟)，冰浴下碎解，低溫離心10 min，取上清液，用BCA 蛋白濃度測(cè)定法進(jìn)行定量。每孔加入等量蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜、封閉，加入ORAI1一抗(1∶500)、β-actin 一抗(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 500)，室溫孵育1.5 h，TBST 漂洗3 次后用ECL 熒光發(fā)光試劑盒顯影。凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，以目的蛋白與β-actin 灰度值的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況:細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)72 h 后，消化并計(jì)數(shù)，制成1 ×107/L 細(xì)胞懸液，每孔接種200 μL 至96 孔板內(nèi)，每組設(shè)6 個(gè)平行孔。即刻、24、48、72 和96 h 加入MTT(5 g/L)20 μL/孔，4 h后去上清液，加150 μL/孔二甲基亞砜(DMSO)，在全波長(zhǎng)自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm 處比色測(cè)吸光度值(A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.6 計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間:細(xì)胞處理同1.2.5，各取2 ×103細(xì)胞加入6 孔板，每組設(shè)6 個(gè)平行孔，培養(yǎng)7 d，第7 天消化、計(jì)數(shù)，計(jì)算倍增時(shí)間(h)=7 ×［lg2/(lgN7-lgN0)］×24(N0 首次細(xì)胞數(shù)、N7 為第7 天細(xì)胞數(shù))，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.7 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力:細(xì)胞處理同1.2.5，取5 ×102細(xì)胞加入24 孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)15 d;棄上清，用PBS 浸洗2 次，加入4% 多聚甲醛固定15 min;去除固定液，加入結(jié)晶紫染色10 min;用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥;用CanoScan 9000F MarkII 掃描儀進(jìn)行集落掃描，計(jì)數(shù)每孔集落數(shù)(以大于50 個(gè)細(xì)胞聚集計(jì)為1 個(gè)集落)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及增殖指數(shù):細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)72 h 后，消化離心，PBS 洗2 次，加入預(yù)冷70%乙醇1 mL，4 ℃固定24 h，送重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院流式細(xì)胞儀室進(jìn)行細(xì)胞周期測(cè)定，增殖指數(shù)= (S + G2)/(G1+ S + G2)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.9 細(xì)胞Ca2+內(nèi)流的測(cè)定:細(xì)胞培養(yǎng)72 h 后，消化后鋪于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿(35 mm)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%匯合，棄原培養(yǎng)基，用PBS 輕柔沖洗3遍，加入含5 μmol/L Ca2+敏感性熒光探針Rhod-2/AM 的D-Hanks 液(無(wú)鈣、無(wú)酚紅)，在37 ℃孵育35 min，用D-Hanks 液洗去多余的Rhod-2/AM，再加入500μL 無(wú)鈣D-Hanks 液孵育30 min。利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)胞內(nèi)Ca2+濃度，激發(fā)波長(zhǎng)557 nm，發(fā)射波長(zhǎng)581 nm，每個(gè)皿選1 個(gè)視野。激光共聚焦顯微鏡常規(guī)掃描30 s 后加入含2 μmol/L TG 和5 μmol/L Nifedipine 的D-Hanks，繼續(xù)每6 s 掃描1 次，待細(xì)胞熒光強(qiáng)度基本恢復(fù)基線后，再加入5 mmol/L 的CaCl2，繼續(xù)掃描觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化，以胞內(nèi)鈣熒光變化曲線的峰值評(píng)估SOCE。胞內(nèi)Ca2+濃度的變化用F/ F0 比值表示，Ca2+釋放或內(nèi)流的幅度以熒光強(qiáng)度上升的最大值(Fmax-F0)與F0 的比值表示(Fmax/F0-1)，其中F0 為未作任何處理時(shí)細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光值，F(xiàn) 為任意時(shí)間點(diǎn)的熒光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.10 Western blot 檢測(cè)ERK1/2、p-ERK1/2 和CyclinD1 蛋白表達(dá):實(shí)驗(yàn)方法同1.2.4，一抗稀釋濃度:ERK1/2 一抗(1 ∶800)、p-ERK1/2 一抗(1∶800)、CyclinD1 一抗(1 ∶1 000)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所有數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組之間比較采用單因素方差分析，兩組之間的比較采用LSD 方法。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒感染SW480 細(xì)胞系的情況

熒光顯微鏡觀察顯示，重組慢病毒和空載體慢病毒感染SW480 細(xì)胞系的效率均達(dá)90%以上(圖1)。

圖1 重組慢病毒感染SW480 的熒光圖像Fig 1 Fluoroscopic image of SW480 infected recombinant lentivirus(×200)

2.2 ORAI1 表達(dá)的變化

干擾組ORAI1 mRNA 的表達(dá)量約為對(duì)照組的0.21 倍(P＜0.01)，蛋白的相對(duì)表達(dá)量約為對(duì)照組的0.39 倍(P＜0.01)(圖2)。

2.3 細(xì)胞增殖的變化

2.3.1 細(xì)胞增殖曲線:干擾組細(xì)胞增殖速度明顯慢于對(duì)照組和空病毒組細(xì)胞(P＜0.05)(表1)。

2.3.2 細(xì)胞倍增時(shí)間:干擾組倍增時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組和空病毒組(P＜0.01)(表2)。

2.3.3 細(xì)胞集落形成:干擾組細(xì)胞形成的集落數(shù)(32.3 ±4.2)明顯少于對(duì)照組(92.7 ±4.5)和空病毒組(98.3 ±12.1)(P＜0.01)(圖3)。

2.4 細(xì)胞周期情況

較對(duì)照組和空病毒組，干擾組G1期細(xì)胞增加、S 期細(xì)胞減少、增殖指數(shù)減小(P＜0.05)(表3，圖4)。

圖2 3 組細(xì)胞ORAI1 表達(dá)變化Fig 2 Expression change of ORAI1 in three groups of cells

表1 三組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值測(cè)定Table 1 The absorbal value of three groups of cells at different time points(±s，n=3)

表1 三組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值測(cè)定Table 1 The absorbal value of three groups of cells at different time points(±s，n=3)

＊P＜0.05 compared with control group.

grouptime(hour)0 24487296 control group0.495 ±0.0250.722 ±0.0140.9 64 ±0.0941.528 ±0.0141.771 ±0.118 empty virus group0.484 ±0.0190.651 ±0.0481.015 ±0.0961.619 ±0.0801.684 ±0.094 interference group0.488 ±0.0420.615 ±0.1110.724 ±0.010*1.021 ±0.122*1.212 ±0.030*

表2 三組細(xì)胞的倍增時(shí)間Table 2 The doubling time of three groups of cells(±s，n=3)

表2 三組細(xì)胞的倍增時(shí)間Table 2 The doubling time of three groups of cells(±s，n=3)

＊P＜0.01 compared with control group.

groupinitial cell number(×103)cell number on the 7th day(×105)doubling time(hours)control group2.01.470 ±0.04626.95 ±0.15 empty virus group2.01.410 ±0.03527.24 ±0.16 interference group2.00.426 ±0.25237.94 ±0.72*

表3 ORAI1 基因?qū)W480 細(xì)胞周期的影響Table 3 The effect of ORAI1 gene on the cell cycle of SW480 (±s，n=3)

表3 ORAI1 基因?qū)W480 細(xì)胞周期的影響Table 3 The effect of ORAI1 gene on the cell cycle of SW480 (±s，n=3)

＊P＜0.05 compared with control group.

groupG1(%)S(%)G2(%)proliferation index control group42.29 ±1.2841.99 ±0.42 15.71 ±1.050.577 ±0.013 empty virus group40.49 ±5.4142.92 ±6.7316.58 ±2.960.595 ±0.054 interference group57.58 ±2.18*27.68 ±3.83*14.74 ±1.700.424 ±0.023*

2.5 外鈣內(nèi)流(SOCE)在各組細(xì)胞中的變化

各組細(xì)胞均成功標(biāo)記鈣離子熒光探針Rhod-2AM(圖5)，較對(duì)照組和空病毒組，干擾組的SOCE上升最大幅度明顯下降(P＜0.05)。SOCE 曲線所代表的是不同時(shí)間點(diǎn)同一培養(yǎng)皿同一視野下多個(gè)細(xì)胞熒光比值的平均值(F/F0)(圖6)。

2.6 各組細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2 和CyclinD1 蛋白表達(dá)差異

干擾組p-ERK1/2 和CyclinD1 蛋白表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組和空病毒組(P＜0.01)(圖7)。

圖3 三組細(xì)胞形成的平板集落Fig 3 Colonys formed by three groups of cells on plates(×10)

圖4 三組細(xì)胞的細(xì)胞周期圖片F(xiàn)ig 4 Cell cycle images of three groups of cells

圖5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞標(biāo)記鈣離子探針Rhod-2AM 的熒光圖像(同一視野)Fig 5 Fluoroscopic image of infected cells markered by Ca2+ indicator Rhod-2AM(×400)

圖6 3 組細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度Fig 6 Ca2+ fluorescence intensity of three groups of cells

圖7 各組細(xì)胞ERK1/2，p-ERK1/2 和cyclinD1 蛋白的表達(dá)Fig 7 The proteins expression of ERK1/2，p-ERK1/2 and cyclinD1 in each group

3 討論

SOCC 介導(dǎo)的SOCE 是非興奮細(xì)胞產(chǎn)生Ca2+內(nèi)流的主要方式，它通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+的濃度，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化等生命活動(dòng)［4］。有研究者發(fā)現(xiàn)［5］，沉默ORAI1 基因后上皮細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，并且這個(gè)抑制效應(yīng)比沉默STIM1 基因強(qiáng)，因此本研究也選用ORAI1 作為研究標(biāo)靶。Umemura M等也發(fā)現(xiàn)［6］，ORAI1 介導(dǎo)的SOCE 通過CaMKII/Raf-1/ERK 通路調(diào)節(jié)惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖。

本實(shí)驗(yàn)在沉默SW480 細(xì)胞ORAI1 的表達(dá)后，通過MTT 法、集落形成法和計(jì)算倍增時(shí)間，發(fā)現(xiàn)干擾組細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，倍增時(shí)間延長(zhǎng)，集落形成能力減弱，結(jié)果表明阻斷ORAI1 的表達(dá)能抑制SW480 的增殖。細(xì)胞增殖依賴于細(xì)胞周期的進(jìn)程［7］。為了進(jìn)一步明確沉默ORAI1 是通過影響細(xì)胞周期的哪一期而抑制SW480 的增殖，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了流式細(xì)胞儀的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)干擾組細(xì)胞阻滯在G1期，增殖能力減弱。由此可以推測(cè)，ORAI1 通過調(diào)控細(xì)胞G1/S 期轉(zhuǎn)換來(lái)促進(jìn)SW480 的增殖。

Ca2+在細(xì)胞G1/S 期轉(zhuǎn)折中發(fā)揮了重要作用，當(dāng)胞內(nèi)Ca2+濃度降低時(shí)，細(xì)胞停滯在G1期，而恢復(fù)Ca2+濃度時(shí)進(jìn)展到S 期［8］。為了研究Ca2+是否參與干擾組細(xì)胞的G1期阻滯，本研究檢測(cè)了3 組細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流，在TG 誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣庫(kù)耗竭和Nifedipine抑制VDCC 通道干擾的情況下，增加外鈣濃度，發(fā)現(xiàn)干擾組SOCE 較對(duì)照組明顯下降，胞內(nèi)Ca2+濃度降低。由此推測(cè)，沉默ORAI1 是通過抑制SOCE，降低胞內(nèi)Ca2+濃度，將SW480 阻滯在G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。

那么胞內(nèi)Ca2+又是如何影響細(xì)胞周期的呢?Ca2+可以直接通過與CaM (鈣調(diào)蛋白)結(jié)合激活Ras，再通過激活raf、MEK 級(jí)聯(lián)，從而激活ERK1/2［9］。活化的ERK1/2 誘導(dǎo)CyclinD1 的表達(dá)［10］，CyclinD1再通過參與G1/S 期轉(zhuǎn)換啟動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程［11］。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn):較對(duì)照組和空病毒組，干擾組細(xì)胞內(nèi)磷酸化ERK1/2 減少，CyclinD1 表達(dá)降低。結(jié)果說(shuō)明Ca2+促進(jìn)了SW480 細(xì)胞內(nèi)ERK1/2 活化及CyclinD1 表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在SW480 中，ORAI1 通過介導(dǎo)SOCE 促進(jìn)胞外Ca2+內(nèi)流，引起ERK1/2 磷酸化和CyclinD1 表達(dá)升高，通過MAPK 通路調(diào)控SW480 細(xì)胞由G1期進(jìn)入S 期，促進(jìn)SW480 的增殖。將在后續(xù)的研究中從多方面(如:PKC、Wnt 信號(hào)通路等)對(duì)ORAI1 調(diào)控SW480 增殖的機(jī)制進(jìn)行探討，從闡明ORAI1 與結(jié)腸癌進(jìn)展的關(guān)系上為結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展提供新的理論依據(jù)。

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