劉明明，李炳蔚，王 冰，孟凡星，趙永剛，盛有明，李宏偉，修瑞娟

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院微循環(huán)研究所衛(wèi)生部微循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100005)

胰島周細(xì)胞分布于胰島毛細(xì)血管和微血管管壁，是胰島微循環(huán)的重要組成細(xì)胞之一，具有維持胰島β 細(xì)胞正常生理功能的作用。胰島周細(xì)胞數(shù)量及功能異?？赡苁翘悄虿〖捌洳l(fā)癥的病理生理基礎(chǔ)［1］。周細(xì)胞具有組織來(lái)源特異性，應(yīng)用胰島周細(xì)胞研究其在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用更為合理。本研究旨在建立大鼠原代胰島周細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定方法，為研究周細(xì)胞及胰島微循環(huán)在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用提供細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF 級(jí)8 周齡雄性Wistar 大鼠，質(zhì)量200～250 g［北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001］。本研究經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院微循環(huán)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑:膠原蛋白酶V、Histopaque-1077、雙硫腙(dithizone，DTZ)(Sigma 公司);內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Sciencell公司);兔抗大鼠vWF 抗體(Santa Cruz 公司);兔抗大鼠α-SMA抗體、兔抗大鼠PDGFR-β(Abcam 公司)和Alexa Fluor 488 驢抗兔IgG(Life Technologies 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠胰島的分離與純化:膽總管穿刺注入1 g/L 膠原蛋白酶V 10 mL，37 ℃15 min。振蕩1 000 r/min 2 min至細(xì)沙狀，10 mL Histopaque-1077 重懸，加入10 mL 培養(yǎng)基，2 000 r/min 20 min，吸取中間層細(xì)胞。解剖顯微鏡下分揀胰島，DTZ 染色鑒定，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)72 h。

1.3.2 大鼠胰島周細(xì)胞的培養(yǎng):胰島懸浮于內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，2～3 d 換液，待胰島周細(xì)胞爬出并增殖至完全匯合后，消化傳代鋪EZ Slide(Millipore 公司)，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)。1.3.3 大鼠胰島周細(xì)胞的鑒定:4%多聚甲醛固定;0.3%Triton X-100 15 min;PBS 清洗，4% 牛血清白蛋白37 ℃30 min;按1∶100 分別加入抗PDGFR-β，α-SMA 或抗vWF 抗體，4 ℃過(guò)夜;PBS 清洗，按1∶1 000 加入Alexa Fluor 488 驢抗兔IgG，37 ℃避光1 h，PBS 清洗;DAPI 染核，鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 大鼠胰島分離與鑒定:大鼠原代胰島呈圓形或橢圓形，包膜完整，大小不一(圖1A);經(jīng)DTZ 染色鑒定(圖1B)，可見(jiàn)胰島形態(tài)較為完整，細(xì)胞碎片較少，胰島純度較高。

圖1 大鼠胰島的分離與純化鑒定Fig 1 Isolation and purification of rat pancreatic islets (× 150)

2.2 大鼠胰島周細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及生長(zhǎng)規(guī)律:胰島周細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，24 h 后貼壁，可伸出偽足(圖2A);7 d 逐漸從胰島中爬出(圖2B)，呈不規(guī)則多邊形，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)致密絲狀結(jié)構(gòu)，接觸抑制不明顯，可重疊生長(zhǎng)(圖2C，2D)。21 d 至匯合狀態(tài)，消化傳代后生長(zhǎng)速度加快，7 d 進(jìn)入對(duì)數(shù)期，14 d 進(jìn)入平臺(tái)期。

2.3 大鼠胰島周細(xì)胞免疫熒光鑒定:胰島周細(xì)胞α-SMA 表達(dá)陽(yáng)性(圖3A，B，C)，PDGFR-β 表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(圖3D，E，F(xiàn));細(xì)胞中可見(jiàn)部分vWF 陽(yáng)性細(xì)胞，提示存在少量胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞混雜(圖3G，H，I)。

圖2 大鼠胰島周細(xì)胞生長(zhǎng)情況Fig 2 The growth of rat islet pericytes (×400)

圖3 大鼠胰島周細(xì)胞免疫熒光鑒定Fig 3 Identification of rat islet pericytes by immunofluorescence (×400)

3 討論

獲得穩(wěn)定傳代的胰島周細(xì)胞系是探討其在糖尿病發(fā)病機(jī)制中作用的基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)胰島周細(xì)胞系報(bào)道，本研究大鼠原代胰島周細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定方法為建立胰島周細(xì)胞系奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

目前尚無(wú)單一表面分子可獨(dú)立標(biāo)記周細(xì)胞。本研究應(yīng)用α-SMA 和PDGFR-β 兩種表面分子結(jié)合胰島微血管管徑對(duì)胰島周細(xì)胞鑒定。胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的PDGF 與周細(xì)胞表面PDGFR-β 結(jié)合促進(jìn)其遷移增殖，胰島素有利于胰島周細(xì)胞生長(zhǎng)，因此本研究未挑除胰島及胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

胰島周細(xì)胞功能異?？蓪?dǎo)致胰島微循環(huán)功能障礙［2］，損傷胰島β 細(xì)胞。因此，建立胰島周細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定技術(shù)對(duì)闡明周細(xì)胞和胰島微循環(huán)在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用、篩選糖尿病治療新靶點(diǎn)具有重要意義。

［1］Beltramo E，Porta M.Pericyte loss in diabetic retinopathy:mechanisms and consequences［J］.Curr Med Chem，2013，20:3218-3225.

［2］Tang SC，Chiu YC，Hsu CT，et al.Plasticity of Schwann cells and pericytes in response to islet injury in mice［J］.Diabetologia，2013，56:2424-2434.