馬友楠，高瑞通，吳鳳岐，高鳳英，張 偉*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫系，北京100005;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，北京100730;3.首都兒科研究所風(fēng)濕免疫科，北京100020;4.三河市兒童醫(yī)院內(nèi)科，河北廊坊101601)

乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)是轉(zhuǎn)鐵蛋白家族中的一員，廣泛存在于各種分泌液及中性粒細胞的次級顆粒中［1］。LF 不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運，還能調(diào)控細胞的生長和分化，具有抗炎活性，抑制腫瘤的發(fā)生及遷移等種種功能［2-4］。LF 在體液中的含量與中性粒細胞數(shù)目密切相關(guān)［5］，而大多數(shù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(systemic lupus erythematosus，SLE)患有中性粒細胞減少癥［6］。但關(guān)于LF 和自身免疫疾病之間的相互關(guān)系研究不多，且LF 與許多免疫細胞間的相互作用機制尚不明確。因此，本研究著重研究LF 在SLE 患者外周血中的含量變化及其影響因素。

1 材料與方法

1.1 病例資料

兒童SLE 患者的樣本及資料收集于2001年至2012年，來自北京首都兒科研究所風(fēng)濕免疫科，共38 例，男性7 例，女性31 例，平均年齡(10.3 ±2.6)歲，年齡范圍在2～18 歲之間。成人SLE 患者的樣本和資料收集于2012年，來自于北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，共46 例，男性5 例，女性41 例，平均年齡(31.9 ±11.5)歲，年齡范圍在18～50 歲之間。所有SLE 患者的癥狀都符合由美國風(fēng)濕學(xué)會所制訂的分類標(biāo)準(zhǔn)［7］中的至少4 項。健康兒童和健康成人樣本及資料來自于常規(guī)體檢人群且在樣本收集時未發(fā)現(xiàn)有風(fēng)濕病及其他疾病。IgA 腎病患者的樣本及資料來自于北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，共29 例，男性15 例，女性14 例，平均年齡(29.3 ±6.2)歲，年齡范圍在17～40 歲之間，所有患者經(jīng)腎臟穿刺活檢確診為IgA 腎病。其他腎病患者樣本及資料來自北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，經(jīng)腎活檢確診為非IgA 腎病，包括紫癜性腎炎4 例、新月體性腎炎3 例、缺血性腎損傷2例、膜性腎炎8 例和惡性高血壓腎損傷2 例，共19例，男性11 例，女性8 例，平均年齡(34.2 ±11.9)歲，年齡范圍在13～51 歲之間。

1.2 主要試劑

BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)，牛血清白蛋白(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所)，2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽ABTS(Amresco 公司)，Tween-20(Fluka 公司)。小鼠抗人乳鐵蛋白抗體KT14 和HRP 標(biāo)記的小鼠抗人乳鐵蛋白抗體KT12(均購自北京愛博生公司)。

1.3 主要方法

1.3.1 ELISA 檢測血清乳鐵蛋白含量:酶標(biāo)板中包被KT14，用包被液稀釋至2 mg/L，100 μL/孔，4 ℃過夜。含0.05% Tween-20 的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗板4 次，加入含2%牛血清白蛋白(BSA)的PBST 封閉液200 μL/孔，室溫封閉2 h。用封閉液以1∶100 稀釋血清樣本，100 μL/孔，室溫孵育1 h。PBST 洗板4 次，用PBST 以1∶1000 稀釋KT12，100 μL/孔，室溫孵育1 h。PBST 洗板4 次，每孔加入100 μL ABTS 顯色液，室溫避光顯色30 min，測定405 nm 波長下吸收值。

1.3.2 BCA 試劑盒檢測血清中總蛋白含量:用BSA(試劑盒自帶，濃度2 g/L)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度梯度為:1.6、0.8、0.4、0.2 和0.1 g/L，用PBS 以1∶100稀釋待測樣本，每孔中加25 μL 待測樣品或BSA 標(biāo)準(zhǔn)品。以50∶1 比例混合A 液和B 液，200 μL/孔，37 ℃孵育30 min。測定562 nm 波長下吸收值。根據(jù)BSA 標(biāo)準(zhǔn)品計算出樣品蛋白濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism(Version 5.01)軟件進行分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)中，非配對t 檢驗用于兩組間差別分析，配對t 檢驗用于組內(nèi)差別分析。Mann-Whitney 檢驗用于非正態(tài)數(shù)據(jù)的分析。Spearman's 檢驗用于計算非正態(tài)分布數(shù)據(jù)間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 SLE 患者血清LF 的含量顯著低于健康對照

兒童及成人SLE 患者血清LF 的水平均顯著低于性別和年齡匹配的健康兒童及成人(圖1)。

2.2 SLE 患者血清中LF 含量的降低與血清中總蛋白水平無關(guān)

SLE 患者與健康人血清總蛋白的水平無顯著差別，且血清LF 的水平與總蛋白水平不存在相關(guān)性(圖2)。

2.3 SLE 患者血清中LF 水平的降低與腎損傷無關(guān)

IgA 腎病(IgA nephropathy，IgAN)及其他腎病患者(disease control，DC)血清LF 水平低于健康人(P＜0.05)，IgAN 與DC 兩組間無差異，但健康人、IgAN 及DC 患者血清LF 水平均顯著高于SLE 患者(P＜0.001)(圖3A)。并且，四組間血清中總蛋白含量無差異(圖3B)。IgAN(圖3C)及DC(圖3D)血清中LF 與總蛋白水平同樣不存在相關(guān)性。

圖1 SLE 患者與健康人血清中LF 水平的比較Fig 1 Comparison of LF levels in SLE patients and healthy subjects

圖2 血清中總蛋白與LF 的相關(guān)性Fig 2 Correlations between serum LF levels and total protein

2.4 血清LF 水平隨年齡增長變化的趨勢分析

1 歲至50 歲健康人血清LF 的水平基本一致，51 歲至80 歲健康人血清中LF 水平有所降低(P＜0.05)(圖4A)。1 歲至50 歲健康男性血清LF 的水平略高于女性，但不具有顯著差異(圖4B)。50 歲至80 歲健康男性和女性間LF 的水平基本一致(圖4C)。

3 討論

SLE 是一種復(fù)雜疾病，患者免疫系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致自身抗體的產(chǎn)生，同時機體發(fā)生多種異常變化，最終導(dǎo)致各種病理性后果。部分SLE 患者伴有腎損傷，腎損傷的標(biāo)志是蛋白尿、尿沉渣異常，影像學(xué)檢查變化或某些綜合征時特殊的血尿成份異常。

圖3 SLE 患者和其他腎病患者血清LF 水平的分析Fig 3 LF levels in SLE patients and patients with renal diseases

圖4 血清中LF 含量與年齡和性別之間的關(guān)系Fig 4 Variations of LF levels with different age and gender

本實驗檢測了健康人及SLE 患者血清LF 的含量。結(jié)果顯示，SLE 患者血清LF 水平均顯著低于性別和年齡匹配的健康人。進一步研究發(fā)現(xiàn)SLE 患者血清中LF 水平的降低并不是總蛋白的變化引起的，與腎損傷也無直接關(guān)系，那么患者LF 降低的原因可能為其合成量過少或消耗過多。LF 在血液中含量與中性粒細胞數(shù)目密切相關(guān)［5］，由于很多SLE患者存在中性粒細胞減少情況［6］，推測中性粒細胞的減少可能導(dǎo)致患者LF 合成量降低。已有報道表明SLE 患者存在抗LF 的自身抗體［8］，這些自身抗體可能與LF 結(jié)合形成免疫復(fù)合物被機體吞噬細胞吞噬清除，導(dǎo)致LF 水平下降。另外，SLE 患者中性粒細胞激活后脫顆粒并釋放NETs［9］。次級顆粒中所含的LF 將吸附到NETs 上，而不是以游離狀態(tài)釋放到血中，這也可能是患者血清LF 水平較低的原因之一。

LF 在機體抗感染方面發(fā)揮作用，推測其水平降低將對抗感染不利。SLE 患者普遍存在易感染情況，其LF 水平較低可能是原因之一。除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)50 歲以上健康人血清LF 含量也較低。推測這將影響老年人機體抗感染能力，但LF 的降低是否與該人群較易得SLE 有關(guān)需進一步研究。

綜上，LF 在SLE 患者血清中水平顯著降低，為檢測SLE 疾病提供了一種可能的生物標(biāo)志物。但其降低原因并不明了，還需進一步研究證明，本研究只是排除了總蛋白和腎損傷兩個因素的影響。利用SLE 小鼠模型進一步研究LF 與SLE 疾病間的關(guān)系，探討LF 的降低是否與其易得SLE 有關(guān)。

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