柯 星，張淑平，吳 夢，黃 蕾，孫瑞紅，黃珮珺，潘世揚，王 芳

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗學(xué)部國家臨床檢驗重點?？平ㄔO(shè)單位，江蘇南京210029)

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是最常見的女性惡性腫瘤之一，發(fā)現(xiàn)時常已發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)作為一類Zn2+依賴的細(xì)胞外蛋白水解酶，它可以降解基底膜，有促進腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的功能。近年來研究認(rèn)為，MMP-9(明膠酶B/92 kDa Ⅳ型膠原酶)在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，尤其是在卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用［1］。已有報道認(rèn)為內(nèi)外源性配體可識別和激活模式分子受體——Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)，進一步活化多種信號傳導(dǎo)途徑，從而最終介導(dǎo)MMPs 的表達(dá)［2］。而腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞可受腫瘤因素誘導(dǎo)分化，成為M2型巨噬細(xì)胞，即腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophage，TAMs)，促進腫瘤發(fā)生和演進［3］。但卵巢癌微環(huán)境中的M2 型巨噬細(xì)胞對卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用和機制目前尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、單核巨噬細(xì)胞系THP-1(中國科學(xué)院細(xì)胞庫);RPMI 1640 培養(yǎng)基、McCoy's 5A 培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone 公司);FITC 標(biāo)記小鼠抗人CD206 抗體(BD 公司);兔抗人MMP-9 抗體和兔抗人MyD88 抗體(Cell signaling 公司);Toll 受體激動劑(San Diego 公司);SYBR? Premix Dimer-EraserTM(TaKaRa 公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將THP-1 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，SKOV3 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的McCoy's 5A 中于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)，THP-1細(xì)胞為懸浮增殖，SKOV3 細(xì)胞為貼壁增殖，SKOV3 細(xì)胞80%匯合時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)增殖期的細(xì)胞用于實驗。

1.3 M2 型巨噬細(xì)胞的極化

含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸THP-1 細(xì)胞至1 ×109個/L，加入佛波醇酯，調(diào)整濃度為320 nmol/L，刺激24 h 后，棄上清，PBS 充分洗滌，倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)拍片，并進行后續(xù)的直接免疫熒光或共培養(yǎng)實驗。

1.4 直接免疫熒光

蓋玻片預(yù)先鋪在6 孔板內(nèi)，PMA 處理后THP-1細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，隨后0.5% Triton X-100 透膜15 min，1% BSA 37 ℃封閉30 min，每孔按1 ∶300 加入FITC 標(biāo)記小鼠抗人CD206 抗體。37 ℃避光孵育2 h，PBS 漂洗3 次。抗熒光淬滅劑封片后，小心將片子夾出，倒扣于載玻片上，倒置熒光顯微鏡觀察并攝圖。

1.5 建立共培養(yǎng)實驗體系

M2 型巨噬細(xì)胞(1 ×106個/孔)生長于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板外室，SKOV3(5 ×105個/孔)生長于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)室(0.4 μm 微孔)，同時設(shè)置內(nèi)室為SKOV3(5 ×105個/孔)外室無M2 型巨噬細(xì)胞為對照組。每組設(shè)立3 復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 和48 h。

1.6 TLRs 激動劑刺激細(xì)胞

將SKOV3 以1 × 105個/孔培養(yǎng)于96 孔板，100 μL/孔，分別加入TLR1 激動劑Pam3CSK4(終濃度為1 mg/L)、TLR2 激動劑HKLM(終濃度為1011個/L)、TLR6 激動劑FSL-1(終濃度為1 mg/L)。同時設(shè)立單獨SKOV3 培養(yǎng)無TLRs 激動劑孔為對照組，每組均設(shè)6 個復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)6、12和24 h。

1.7 RNA 提取及RT-PCR

以β-actin 為內(nèi)參照，進行TLR1、TLR2、TLR6和MMP-9 實時熒光定量PCR 檢測(ABI 7500 型)。TLR1 上游引物序列5'-GGAGGCAATGCTGCTGTT-3'，下游引物序列5'-GCCCAATATGCCTTTGTTATC CTG-3';TLR2 上游序列5'-TGTTGCAAGCAGGATCC AAAG-3'，下游序列5'-CACAAAGTATGTGGGCATTG TCCAG-3';TLR6 上游序列5'-CAGAGTGAGTGGTGC CATTACGA-3'，下游序列5'-AGCCTTCAGCTTGTGG TACTTGTTG-3';MMP-9 上游序列5'-GCTCTTCCCTG GAGACCTGA-3'，下游序列5'-CTGCCTAACCCTGG ACACCT-3';β-actin 上游序列5'-TGGCCCCAGCACA ATGAA-3'，下游序列5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTA GAAGCA-3'。PCR 反應(yīng)體系和擴增程序按照說明書。根據(jù)PCR 所得CT 值應(yīng)用2-△△CT法計算TLR1、2、6 和MMP-9 相對表達(dá)量。

1.8 Western blot

Transwell 小室中共培養(yǎng)過程后收集各組細(xì)胞，用BCA 法進行蛋白質(zhì)定量。取30 μg 蛋白質(zhì)/泳道加入5 ×SDS 凝膠加樣緩沖液。以80 V 濃縮膠和120 V 分離膠電泳分離細(xì)胞蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜1 h 50 min。室溫封閉2 h 后，4 ℃搖床一抗孵育過夜;TBST 洗膜10 min×3 次;搖床上二抗室溫孵育2 h;TBST 洗膜10 min×3 次。用DAB-HRP 熒光檢測試劑激發(fā)熒光，GAPDH 蛋白為內(nèi)參照，于暗室顯影和定影后進行圖像分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS16.0 進行分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PMA 刺激前后THP-1 形態(tài)變化

通常未經(jīng)誘導(dǎo)的THP-1 細(xì)胞多呈懸浮生長，多為圓形。圖1 顯示在320 nmol/L PMA 誘導(dǎo)分化12和24 h 后，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)槎噙呅危?xì)胞表面可伸出偽足，胞質(zhì)內(nèi)偶見空泡，細(xì)胞體積明顯增大，24 h 較12 h的刺激時間，THP-1 的極化現(xiàn)象更加明顯。

圖1 PMA 刺激后THP-1 形態(tài)變化Fig 1 THP-1 morphological changes after PMA stimulation (×200)

2.2 THP-1 誘導(dǎo)分化后表面分子標(biāo)志的改變

PMA 誘導(dǎo)后細(xì)胞膜表面有較高的熒光強度，CD206 表達(dá)陽性(圖2A，B)，認(rèn)為THP-1 細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞方向分化。而未經(jīng)PMA 誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞表面CD206 無表達(dá)或低表達(dá)(圖2C，D)。

圖2 THP-1 誘導(dǎo)分化后直接免疫熒光表面CD206 的表達(dá)Fig 2 Detecting CD206 expression by direct immunofluorescence (×200)

2.3 共培養(yǎng)體系對SKOV3 中MMP-9 表達(dá)水平影響

與M2 型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 和48 h 的SKOV3中MMP-9 mRNA 水平明顯高于SKOV3 單獨培養(yǎng)組(P＜0.05)(圖3)。24 和48 h 共培養(yǎng)組中SKOV3的MMP-9 蛋白表達(dá)水平較SKOV3 單獨培養(yǎng)組也明顯提高(圖4)。

圖3 共培養(yǎng)體系對SKOV3 中MMP-9 mRNA表達(dá)水平影響Fig 3 Level changes of MMP-9 mRNA in co-culture system

圖4 共培養(yǎng)體系對SKOV3 中MMP-9 蛋白水平的影響Fig 4 Level changes of MMP-9 protein in co-culture system

2.4 共培養(yǎng)體系對SKOV3 中TLRs 表達(dá)水平影響

共培養(yǎng)24 h 后，TLR1、TLR2 和TLR6 mRNA 表達(dá)水平顯著高于SKOV3 單獨培養(yǎng)組(P＜0.05)(圖5A)，而共培養(yǎng)48 h 后，共培養(yǎng)組中SKOV3 的TLR1、TLR2 和TLR6 mRNA 表達(dá)水平也高于SKOV3 單獨培養(yǎng)組(P＜0.05)(圖5B)。

2.5 共培養(yǎng)體系對SKOV3 中TLRs 信號通路蛋白表達(dá)影響

與M2 型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 和48 h 的SKOV3中TLRs 信號通路蛋白MyD88、TRAF6 和P-NF-κB表達(dá)水平顯著高于SKOV3 單獨培養(yǎng)組(圖6)。

2.6 TLRs 刺激SKOV3 對MMP-9 的影響

圖7 顯示Pam3CSK4 刺激SKOV3 6 h 后，MMP-9 mRNA 水平開始升高，12 和24 h 表達(dá)高于SKOV3 單獨培養(yǎng)組(P＜0.05);然而HKLM 刺激6 h 后，MMP-9 mRNA 水平升高不明顯，但12 和24 h MMP-9 較SKOV3單獨培養(yǎng)組升高(P＜0.05);FSL-1 刺激6、12 和24 h 后，MMP-9 mRNA 水平高于SKOV3 單獨培養(yǎng)組(P＜0.05)。

圖5 共培養(yǎng)體系對SKOV3 中TLRs 表達(dá)水平的影響Fig 5 Level changes of TLRs mRNA in co-culture system

圖6 共培養(yǎng)體系對SKOV3 中TLRs 信號通路蛋白表達(dá)的影響Fig 6 Level changes of TLRs signaling pathway proteins in co-culture system

3 討論

卵巢癌(OC)是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病隱匿，70%～80%患者確診時已到晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)［4］?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是能夠降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，而MMP-9主要降解細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅳ型膠原，從而破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，促進細(xì)胞轉(zhuǎn)移［5-6］。已有文獻(xiàn)明確報道，MMP-9 表達(dá)升高與卵巢癌惡性程度呈相關(guān)性［7］。

圖7 TLR1、2、6 激動劑作用SKOV3 對MMP-9 的影響Fig 7 Effects of TLR1，2 and 6 agonist to MMP-9 mRNA in SKOV3

近十多年來，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在各種刺激劑的作用下，可具有不同的活化狀態(tài)，并在不同的微環(huán)境中發(fā)揮不同的作用［8］。多位學(xué)者認(rèn)為在腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞有向M2 型轉(zhuǎn)化的趨勢，即腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)，能表達(dá)高水平的CD206 和IL-10，可抑制T 細(xì)胞增殖，參與了腫瘤的進展過程。認(rèn)為M2 型巨噬細(xì)胞對卵巢癌內(nèi)皮細(xì)胞血管生成及腫瘤進展發(fā)揮作用［9］。但M2 型巨噬細(xì)胞對卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及具體機制并不清楚。

本實驗建立M2 型巨噬細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞系SKOV3 的共培養(yǎng)系統(tǒng)，24 和48 h 后發(fā)現(xiàn)SKOV3 中MMP-9 表達(dá)水平明顯高于SKOV3 單獨培養(yǎng)組。提示M2 型巨噬細(xì)胞在卵巢癌生長微環(huán)境中可誘導(dǎo)上調(diào)MMP-9 的表達(dá)，增強卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。M2型巨噬細(xì)胞上調(diào)MMP-9 的機制如何?TLRs 是否可能參與這一過程?TLRs 是近年研究較多的跨膜模式識別受體，不僅表達(dá)于免疫細(xì)胞［10］，在人類腫瘤及腫瘤細(xì)胞系同樣有表達(dá)，可能參與腫瘤的發(fā)展演進過程［11］。TLR1、TLR2 和TLR6 是介導(dǎo)炎性反應(yīng)的主要受體，TLRs 活化后，在MyD88 依賴性信號途徑中，可使IRAK 發(fā)生磷酸化改變，進一步促使TRAF6 寡聚化。由活化后的TRAF6 和TAK1 介導(dǎo)活化IKKs，引起IκB 降解，導(dǎo)致NF-κB 亞單位的釋放并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)啟動各種基因轉(zhuǎn)錄［12］。近來發(fā)現(xiàn)TLRs 與腫瘤發(fā)展的行為學(xué)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示共培養(yǎng)后的SKOV3 可高表達(dá)TLR1、2 和6，TLRs 信號通路蛋白MyD88、TRAF6 和P-NF-κB 表達(dá)水平也明顯提高，提示M2 型巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)環(huán)境中，某些因素可活化卵巢癌細(xì)胞TLRs。國外也有類似研究，結(jié)腸癌TLR9 可以通過激活NF-κB 通路來促進直腸癌細(xì)胞LS174 和SW620 發(fā)生侵襲［13］，在黑色素瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是與細(xì)胞內(nèi)TLR4 的活化和NF-κB 通路介導(dǎo)［14］。提示TLRs 在腫瘤細(xì)胞上的高表達(dá)和活化，可能發(fā)揮了一定生物學(xué)功能。

為了探究TLRs 信號通路活化與MMP-9 表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)使用TLR1、2 和6 相應(yīng)激動劑作用后的SKOV3 表現(xiàn)出MMP-9 的表達(dá)增強，而TLR1、2 和6通路活化與MMP-9 表達(dá)上調(diào)有關(guān)，此結(jié)果從側(cè)面提示M2 型巨噬細(xì)胞可以刺激和活化卵巢癌細(xì)胞的TLR1、TLR2 和TLR6 信號通路，使得基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9 表達(dá)增高，MMP-9 可降解、破壞靠近腫瘤表面的細(xì)胞外基質(zhì)，促進卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的過程。但其具體的作用機制有待進一步探索。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)M2 型巨噬細(xì)胞可通過某種機制，刺激卵巢癌細(xì)胞TLR1、TLR2 和TLR6表達(dá)上調(diào)，使TLRs 信號通路活化，進一步促使MMP-9 表達(dá)增加，可能與卵巢癌侵襲生長的生物學(xué)行為有關(guān)。M2 型巨噬細(xì)胞及TLRs 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，能為TAM與卵巢癌及其相互關(guān)系的發(fā)病機制研究提供了新的思路。

［1］Ding X，F(xiàn)ang L，Zhang H，et al.Invasiveness of mouse embryos to human ovarian cancer cells HO8910PM and the role of MMP-9［J］.Cancer Cell Int，2012，12:23.

［2］Lim KH，Staudt LM.Toll-like receptor signaling［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol.2013，5:a011247.doi:10.1101/cshperspect.a011247.

［3］Wang R，Lu M，Zhang J，et al.Increased IL-10 mRNA expression in tumor-associated macrophage correlated with late stage of lung cancer［J］.J Exp Clin Cancer Res.2011，30:62.

［4］Wang B，Liu SZ，Zheng RS，et al.Time trends of ovarian cancer incidence in China［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15:191-193.

［5］劉旺根，張欽憲，王云龍，等.ER-α36 過表達(dá)促進人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33:713-717.

［6］Ghosh S，Basu M，Roy SS.ETS-1 protein regulates vascular endothelial growth factor-induced matrix metalloproteinase-9 and matrix metalloproteinase-13 expression in human ovarian carcinoma cell line SKOV-3［J］.J Biol Chem，2012，287:15001-150015.

［7］Schmalfeldt B，Prechtel D，H?rting K，et al.Increased expression of matrix metalloproteinases (MMP)-2，MMP-9，and the urokinase-type plasminogen activator is associated with progression from benign to advanced ovarian cancer［J］.Clin Cancer Res，2001，7:2396-2404.

［8］Stein M，Keshav S，Harris N，et al.Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity:a marker of alternative immunologic macrophage activation［J］.J Exp Med，1992，176:287-292.

［9］Wang X，Zhao X，Wang K，et al.Interaction of monocytes/macrophages with ovarian cancer cells promotes angiogenesis in vitro［J］.Cancer Sci，2013，104:516-523.

［10］徐娟，潘世揚，王芳，等.卵巢癌患者TLR1、TLR2、TLR6 信號通路活化誘導(dǎo)PBMC 前炎癥細(xì)胞因子分泌［J］.臨床檢驗雜志，2013，8:584-587.

［11］Liu CY，Xu JY，Shi XY，et al.M2-polarized tumor-associated macrophages promoted epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer cells，partially through TLR4/IL-10 signaling pathways［J］.Lab Invest，2013，93:844-854.

［12］Pinto A，Morello S，Sorrentino R.Lung cancer and Tolllike receptors［J］.Cancer Immunol Immunother，2011，60:1211-1220.

［13］Rath T，St?ckle J，Roderfeld M，et al.Matrix metalloproteinase 13 is regulated by toll-like Receptor-9 in colorectal cancer cells and mediates cellular migration［J］.Oncol Lett，2011，2:483-488.

［14］Voelcker V，Gebhardt C，Averbeck M，et al.Hyaluronan fragments induce cytokine and metalloprotease upregulation in human melanomacells in part by signalling via TLR4［J］.Exp Dermatol，2008，17:100-107.