時春麗，蔣 磊，肖獻忠*

(湖南省婦幼保健院 中南大學 1.檢驗科； 2.湘雅醫(yī)學院 病理生理學教研室， 湖南 長沙 410008)

研究論文

過表達MIPU1降低阿霉素所致人胚胎腎HEK293細胞的凋亡

時春麗1，蔣 磊2，肖獻忠2*

(湖南省婦幼保健院 中南大學 1.檢驗科； 2.湘雅醫(yī)學院 病理生理學教研室， 湖南 長沙 410008)

目的探討過表達MIPU1對阿霉素(Doxorubicin,DOX)所致細胞凋亡的影響及其可能的分子機制，為預防DOX抗腫瘤治療過程中的毒副作用提供新的思路。方法1)MTT實驗觀察DOX處理下過表達MIPU1對細胞存活率的影響；2)Hoechst染色和流式細胞術(shù)分析過表達MIPU1對DOX所致細胞凋亡的影響；3)RT-PCR和Western blot分析過表達MIPU1對DOX所致Bcl- 2、P53和Bax在mRNA水平和蛋白水平上表達變化的影響。結(jié)果過表達MIPU1后，細胞存活率明顯升高(Plt;0.05vspEGFP+DOX)，凋亡率顯著下降(Plt;0.01vspEGFP+DOX)，P53和Bax的表達顯著下降(Plt;0.05vspEGFP+DOX)，而Bcl- 2的表達則明顯增多(Plt;0.05vspEGFP+DOX)。結(jié)論過表達MIPU1能降低DOX引起的HEK293細胞凋亡，可能與抑制P53和Bax的表達同時促進Bcl- 2的表達有關(guān)。

細胞凋亡；阿霉素； MIPU1；Bax；Bcl- 2

Mipu1(myocardial ischemic preconditioning up-regulated gene 1)是在大鼠心肌缺血預適應(yīng)中發(fā)現(xiàn)的一種表達上調(diào)的新基因，其蛋白是一種KRAB型鋅指蛋白，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。針對大鼠的Mipu1已做了很多的功能研究[1- 3]，并發(fā)現(xiàn)過表達Mipu1能分別抑制H2O2和TNF-ɑ誘導的Fas和Bid蛋白的表達，且這種抗凋亡作用與直接和啟動子結(jié)合而抑制其表達有關(guān)[4]。

阿霉素是臨床常用的抗腫瘤藥物，在發(fā)揮其強大抗腫瘤作用[5]的同時出現(xiàn)了很多副作用，其中在阿霉素腎病模型中，腎小球硬化，腎小管萎縮，在硬化區(qū)和萎縮區(qū)凋亡細胞數(shù)明顯增多[6]。在阿霉素導致的腎臟損傷中，某些凋亡蛋白發(fā)生了明顯的變化[7]。Mipu1作為一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白，其能否在DOX所致的細胞損傷中發(fā)揮保護作用則還不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎腎細胞HEK293(American type culture collection,ATCC)；DMEM(Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物)；阿霉素(Doxorubicin,貨號44583，Sigma公司)；pEGFP-MIPU1質(zhì)粒； Bax抗體(Epitomics公司)；Bcl- 2抗體、P53抗體(安博生物技術(shù)有限公司)；Mipu1抗體、MTT檢測試劑盒、Hoechst33258(Sigma公司)；GFP抗體(Cell Signaling公司)；流式凋亡檢測試劑盒Annexin ⅴAPC/PI(eBioscience公司)。

1.2 引物序列(表1)1.3 HEK293細胞的培養(yǎng)及處理

細胞按照1×106個/每瓶接種50 cm2培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培基培養(yǎng)。細胞置于37 ℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，待細胞增殖狀態(tài)好匯合度達到80%以上時用來做后續(xù)實驗。根據(jù)實驗要求進行相應(yīng)處理。

1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)步驟

實驗分為兩步進行，具體見說明書。

表1 引物序列Table 1 Primer sequemce

反應(yīng)條件：GAPDH：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25個循環(huán)；MIPU1：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)； Bax：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25個循環(huán)； Bcl- 2：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，32個循環(huán)；P53：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測所擴條帶，凝膠成像系統(tǒng)拍照后Quantity One軟件進行灰度掃描分析。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測目的蛋白

細胞經(jīng)過處理到達時間點PBS洗1～2遍后裂解細胞，超聲15 s，置于冰上繼續(xù)裂解30 min。4 ℃，12 000 r/min離心20 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中即得到細胞的總蛋白。將80 μg蛋白與5×SDS上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸10 min。樣品經(jīng)12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，50 mA穩(wěn)流濕轉(zhuǎn)過夜至PVDF膜上。室溫封閉4 h后加入相應(yīng)一抗，4 ℃反應(yīng)過夜。TBST洗膜液洗3次，每次10 min，加入相應(yīng)二抗，室溫搖床慢速反應(yīng)45 min，TBST洗膜液洗3次，每次10 min，DAB顯色，吸光度掃描定量分析。

1.6Hoechst33258染核，檢測細胞核凋亡形態(tài)及凋亡百分率計算

經(jīng)過實驗處理后4%多聚甲醛固定10 min， Hoechst33258 20 μg/mL染色后孵育15～20 min，熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)。隨機選取3個視野，每個視野200個細胞核，計算凋亡百分率，即凋亡百分率=(凋亡細胞核/200)×100%。

1.7 MTT檢測細胞存活率

細胞接種于96孔板中，濃度為1×107/L，每孔200 μL，根據(jù)實驗處理完細胞后每孔加入20 μL MTT(5 g/L)溶液， 4 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 mL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使甲瓚結(jié)晶物充分溶解，酶標儀490 nm處測量各孔的吸光度值。

1.8 流式細胞數(shù)檢測細胞凋亡

具體按照eBioscience公司的AnnexinⅤ Staining Protocols試劑盒進行操作。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 過表達MIPU1對細胞存活率的影響

HEK293細胞瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP或pEGFP-MIPU1 24 h后1 μmol/L DOX處理24 h，pEGFP+DOX組的細胞存活率比pEGFP組明顯下降，當過表達MIPU1后則細胞存活率明顯增加(圖1)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP;#Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX圖1 MTT實驗檢測過表達MIPU1對細胞存活率的影響Fig 1 Effect of MIPU1 overexpression on DOX-inducedHEK293 cells death using MTT assay(±s,n=3)

2.2Hoechst33258染核觀察過表達MIPU1后細胞凋亡的變化

轉(zhuǎn)染pEGFP和pEGFP-MIPU1后，胞核呈均勻的藍色熒光，當DOX處理24 h后，轉(zhuǎn)染pEGFP的胞核發(fā)生明顯的皺縮，聚集甚至碎裂，細胞發(fā)生了凋亡，而轉(zhuǎn)染pEGFP-MIPU1細胞核的凋亡明顯減少(圖2)。

A.pEGFP; B.MIPU1; C.pEGFP+DOX; D.MIPU1+DOX; *Plt;0.01 compared with pEGFP; #Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX圖2 Hoechst33258染核檢測過表達MIPU1對DOX所致HEK293細胞凋亡的影響Fig 2 Hoechst 33258 staining showed the percentageof apoptosis cells(×200,n=3)

2.3流式細胞術(shù)檢測MIPU1過表達對細胞凋亡率的影響

pEGFP+DOX組的細胞凋亡率較pEGFP組顯著增多；轉(zhuǎn)染MIPU1后細胞凋亡率明顯下降(圖3)。

apoptosis: R3+R5; *Plt;0.01 compared with pEGFP; #Plt;0.01 compared with pEGFP+DOX圖3 流式細胞術(shù)檢測過表達MIPU1對DOX所致HEK293細胞凋亡的影響Fig 3 Effects of MIPU1 overexpression on DOX-induced HEK293 cells apoptosis by flowcytometry(n=3)

2.4過表達MIPU1對DOX所致P53的mRNA表達的影響

與pEGFP組相比，pEGFP+DOX組P53的mRNA表達增多；與pEGFP+DOX組相比，pEGFP-MIPU1+DOX組中P53的mRNA表達受到抑制(圖4)。

圖4 RT-PCR檢測過表達MIPU1對P53mRNA的影響Fig 4 Effect of MIPU1 over-expression on DOX-induced P53 changed levels by RT-PCR

2.5過表達MIPU1對DOX所致P53蛋白表達水平的影響

與pEGFP組相比，pEGFP+DOX組的P53蛋白表達增多；與pEGFP+DOX組相比，pEGFP-MIPU1+DOX組的P53蛋白表達受到明顯抑制(圖5)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP;#Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX圖5 Western blot檢測過表達MIPU1對P53蛋白表達的影響Fig 5 Effect of MIPU1 over-expression on DOX-induced P53 changed levels by Westernblot(n=3)

2.6過表達MIPU1對DOX所致Bax在mRNA水平上表達的變化

與pEGFP組相比， pEGFP+DOX組中Bax的mRNA表達明顯升高，當過表達MIPU1后Bax的mRNA表達明顯受到抑制(圖6)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP；#Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX圖6 RT-PCR檢測 MIPU1轉(zhuǎn)入HEK293細胞后觀察Bax的mRNA水平變化Fig 6 The effect of MIPU1 over-expression on BaxmRNA and by RT-PCR(n=3)

2.7Westernblot檢測過表達MIPU1對DOX所致Bax在蛋白水平上的表達變化

與pEGFP組相比，pEGFP+DOX組的Bax蛋白表達升高；而轉(zhuǎn)入MIPU1后Bax蛋白表達受到明顯抑制(圖7)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP；**Plt;0.01 compared with pEGFP+DOX圖7 Western blot 檢測MIPU1過表達對Bax蛋白變化的影響Fig 7 The effect of MIPU1 over-expression on Baxprotein by Western blot(n=3)

2.8過表達MIPU1對DOX所致Bcl-2在mRNA水平上的影響

與pEGFP組相比，pEGFP+DOX組的Bcl- 2的mRNA表達略有減少，但是轉(zhuǎn)入MIPU1后即pEGFP-MIPU1+DOX組Bcl- 2的mRNA表達則明顯增多(圖8)。

*Plt;0.05 compared with pEGFP；#Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX圖8 RT-PCR檢測過表達MIPU1對Bcl- 2mRNA的影響Fig 8 The effect of MIPU1 over-expression on Bcl- 2mRNA by RT-PCR(n=3)

2.9過表達MIPU1在蛋白水平上對Bcl-2表達的影響

與pEGFP組相比，pEGFP+DOX組的Bcl- 2蛋白表達明顯受到抑制；與pEGFP+DOX組相比，pEGFP-MIPU1+DOX組的Bcl- 2蛋白表達增多(圖9)。

#Plt;0.05 compared with pEGFP；*Plt;0.05 compared with pEGFP+DOX圖9 Western blot檢測過表達MIPU1對Bcl- 2蛋白表達變化的影響Fig 9 The effect of MIPU1 over-expression on Bcl- 2protein by Western blot(n=3)

3 討論

DOX進入體內(nèi)后能代謝為半醌類化合物，與核酸結(jié)合而導致DNA等發(fā)生損傷，從而起到殺傷腫瘤細胞的做用[3]。在整體動物水平上的阿霉素腎病模型中發(fā)現(xiàn)，DOX導致的腎臟毒性中細胞凋亡占了很大一部分的比例。凋亡是細胞的一種程序性死亡方式，對于自身的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、發(fā)展和抵御病原微生物具有重要的作用[8]。Bcl- 2蛋白家族在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用，這一家族根據(jù)功能的不同分成兩大類：1)促進細胞凋亡的蛋白，包括Bax、Bak、Bid、Diva、Bim[9]、Bok和Bcl- XS[10]等。2)抗細胞凋亡的蛋白,包括Bcl- 2[11]、Bcl- XL、Bcl- W和Mcl- 1等。這兩種蛋白的平衡被打破則參與到多種疾病的發(fā)病機制中。 P53的抑癌作用很強，當小鼠敲除P53基因后，發(fā)生癌癥的概率達到百分之百[12]。DOX導致的氧化應(yīng)激能激活細胞凋亡信號通路而導致細胞發(fā)生凋亡[13- 14]。

大鼠Mipu1是一個轉(zhuǎn)錄抑制因子，具有抗H2O2和TNF-α所致的細胞損傷的作用，其機制與抑制某些促凋亡基因的表達有關(guān)。人的MIPU1和大鼠的同源性很高，高達76%，但MIPU1是否在DOX所致的細胞損傷中也具有抗凋亡作用尚不清楚。

本次實驗結(jié)果顯示，DOX能誘導HEK293細胞發(fā)生凋亡，當過表達MIPU1后，細胞的存活率明顯升高，凋亡率下降。進一步探討其可能的分子機制發(fā)現(xiàn)， MIPU1能阻止DOX引起的Bcl- 2的下調(diào)，同時也能抑制DOX誘導的Bax的上調(diào)，使得Bax/Bcl- 2下降。因此MIPU1抗凋亡與促進Bax/Bcl- 2的下調(diào)有關(guān)。另外發(fā)現(xiàn)，過表達MIPU1還能抑制DOX處理下的P53在mRNA水平和蛋白水平上的表達，說明MIPU1在DOX誘導的細胞凋亡模型中發(fā)揮抗凋亡作用的途徑不是單一的，而是多方面的，這為探究MIPU1的抗凋亡作用提供了新的理論依據(jù)。

[1] Wang G, Zuo X, Yuan C,etal. Mipu1, a novel rat zinc-finger protein, inhibits transcriptional activities of AP-m1 and SRE in mitogen-activated protein kinase signaling pathway[J]. Mol Cell Biochem,2009,322:93- 102.

[2] 高敏，王浩，劉瑛，等. Mipu1基因在內(nèi)毒素血癥小鼠組織中的表達研究[J]. 生命科學研究,2010:331- 334.

[3] 屈順林，郭芳，范文靜，等. 心肌細胞缺氧復氧損傷時Mipu1啟動子活性、 Mipu1 mRNA表達變化及意義[J]. 山東醫(yī)藥,2012:5- 7.

[4] 劉小柳，鄧恭華，雷堅，等.Mip1對大鼠心肌細胞Bid基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的初探[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2009:1230- 1236.

[5] Weiss R B. The anthracyclines: will we ever find a better doxorubicin[J]. Semin Oncol,1992,19:670- 686.

[6] 孫良忠，岳智慧，湯潔如，等. 細胞凋亡在阿霉素腎病大鼠腎小球硬化過程中的意義[J]. 中華兒科雜志,2000:27- 29.

[7] 單越新，侯凡凡. 熱休克蛋白60對阿霉素引起的HEK293細胞凋亡的抑制作用[Z]. 中國杭州:389- 390.

[8] Vaux D L. Caspases and apoptosis-biology and terminology[J]. Cell Death Differ,1999,6:493- 494.

[9] O’Connor L, Strasser A, O’Reilly L A,etal. Bim: a novel member of the Bcl- 2 family that promotes apoptosis[J]. EMBO J,1998,17:384- 395.

[10] Chao D T, Korsmeyer S J. Bcl- 2 family: regulators of cell death[J]. Annu Rev Immunol,1998,16:395- 419.

[11] Adams J M, Cory S. The Bcl- 2 protein family: arbiters of cell survival[J]. Science,1998,281:1322- 1326.

[12] Brady C A, Attardi L D. P53 at a glance[J]. J Cell Sci,2010,123:2527- 2532.

[13] Liu B, Bai Q X, Chen X Q,etal. [Effect of curcumin on expression of survivin, Bcl- 2 and Bax in human multiple myeloma cell line][J]. Zhong guo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2007,15:762- 766.

[14] Nitobe J, Yamaguchi S, Okuyama M,etal. Reactive oxygen species regulate FLICE inhibitory protein (FLIP) and susceptibility to Fas-mediated apoptosis in cardiac myocytes[J]. Cardiovasc Res,2003,57:119- 128.

Overexpression of MIPU1 reducesdoxorubicin-induced apoptosis in human embryonic kidney 293 cells

SHI Chun-li1, JIANG Lei2, XIAO Xian-zhong2*

(1.Dept. of Clinical Laboratory, Hunan Maternal and Child Health Hospital;2.Dept. of Pathophysiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410008, China)

ObjectiveTo explore the affection of overexpression MIPU1 on DOX-mediated apoptosis and the mechanisms, so to provide novel insight into the biological functions of Mipu1, and a new clue for preventing the side-effects of DOX during anticancer implication.MethodsApoptosis was induced by Doxorubicin in this experiment. The eukaryotic expression plasmid pEGFP-MIPU1 was constructed previously and delivered into the cells to increase the expression of MIPU1. Firstly, MTT assay was used to estimate the cells viability. Then apoptosis was assessed by Hoechst staining and flow cytometry (FCM). Thirdly, Western blot and RT-PCR were performed to detect the expression of Bax, P53 and Bcl- 2 at the mRNA and protein levels respectively.ResultsAfter transfected with pEGFP-MIPU1, the overexpression of MIPU1 significantly attenuated the mortality rate induced by DOX (Plt;0.05vspEGFP+DOX), and markedly decreased the cellular apoptosis treated with DOX (Plt;0.01vspEGFP+DOX); The overexpression MIPU1 inhibited the increase of P53 and Bax induced by DOX (Plt;0.05vspEGFP+DOX), while reversed the decrease of Bcl- 2 expression in DOX-induced HEK293 cells (Plt;0.05vspEGFP+DOX).ConclusionsOverexpression MIPU1 inhibites apoptosis in HEK293 cells

induced by DOX, and MIPU1 may decrease the expression of P53 and Bax, and promote the expression of Bcl- 2 in DOX-induced HEK293 cells.

apoptosis; Doxorubicin; MIPU1; Bax; Bcl- 2

2014- 03- 06

2014- 05- 27

國家自然科學基金(30971205)；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2007CB512007)

*通信作者(correspondingauthor)：xiaoxianzhong@csu.edu.cn

1001-6325(2014)10-1352-06

R 363

A