王 姣，孫高潔，王守俊

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌及代謝病科河南省高等院校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450052)

哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在兩種不同類型的脂肪細(xì)胞，即棕色脂肪細(xì)胞和白色脂肪細(xì)胞。和主要用于儲(chǔ)存能量的白色脂肪組織相比，棕色脂肪組織因線粒體表達(dá)解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein-1，UCP1)而擁有非顫栗產(chǎn)熱的能力，研究表明體內(nèi)高水平的棕色脂肪組織可阻止代謝性疾病的發(fā)生［1］。全反式維甲酸(all-trans-retnoic acid，t-RA)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分化、生長有重要作用，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，t-RA 有促使大鼠白色脂肪表現(xiàn)出棕色脂肪表型的傾向［2］。本實(shí)驗(yàn)通過研究t-RA 對(duì)小鼠白色脂肪細(xì)胞棕色化的影響，為開辟新的治療肥胖癥、糖尿病等代謝性疾病的方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分化:小鼠3T3-L1 前脂肪細(xì)胞(武漢博士德公司)在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)液中，當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)80%時(shí)，胰蛋白酶消化、傳代。細(xì)胞完全匯合后2 d(誘導(dǎo)分化第0 天)，用以下試劑誘導(dǎo)分化:0.5 mmol/L 的IBMX、1.0 μmol/L 的地塞米松和2 mg/L的胰島素。在48 h(第2 天)后換液，培養(yǎng)中僅有1.0 μmol/L的地塞米松、2 mg/ L 的胰島素，第4 天及以后的換液，不加任何誘導(dǎo)因素，至第8 天。

1.2 油紅O 法鑒定細(xì)胞分化:小心輕緩倒去培養(yǎng)液，用PBS洗2 次，10%甲醛固定30 min，加油紅O 工作液靜止10 min，后用75%乙醇漂洗。加蘇木精靜止5 min 后，用PBS 漂洗2遍。甘油明膠封片，普通顯微鏡下觀察。

1.3 RT-PCR 測UCP1 mRNA 的表達(dá):細(xì)胞以8 ×104個(gè)/孔接種于6 孔板，貼壁24 h，分別以0、1 × 10－5、1 × 10－4、1 ×10－3、1 ×10－2及1 ×10－1mmol/L t-RA 作用24 h。提取RNA，用分光光度計(jì)測量RNA 濃度，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。UCP1 上、下游引物分別為5'-GTACCACATAAG CAACTTGGAG-3'和5'-ATCTTGTAATGTAAATAAAGTC-3'(擴(kuò)增片段長度為106 bp)，β-actin 上、下游引物分別為5'-GA GACCTTCAACACCCCAGC-3'和5'-AGCATTGTAGGTCCCCGT GT-3'(擴(kuò)增片段長度為292 bp)。UCP1 mRNA 表達(dá)水平以UCP1 與β-actin 吸光度比值表示。

1.4 Western blot 測UCP1 蛋白表達(dá):細(xì)胞以8 ×104個(gè)/孔接種于6 孔板，貼壁24 h，分別以0、1 ×10－5、1 ×10－4、1 ×10－3、1 ×10－2及1 ×10－1mmol/L 全反式維甲酸作用24 h。提取蛋白，BCA 法測蛋白濃度;SDS-PAGE 電泳;蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫封閉2 h;一抗4 ℃孵育過夜;辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育1 h;Image Studio Ver 2.0 軟件測吸光度值，UCP1 蛋白表達(dá)水平以UCP1 與β-actin 吸光度比值表示。

2 結(jié)果

2.1 小鼠3T3 前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后形態(tài)改變(圖1，2)

2.2 RT-PCR 結(jié)果顯示(圖3，表1)

2.3 Western blot 結(jié)果顯示(圖4，表1)

圖1 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化前的形態(tài)Fig 1 3T3 －L1 preadipoctes are fibroblasts(×100)

圖2 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)8 d 時(shí)油紅O染色后的形態(tài)Fig 2 On the 8th day after induction with hormones the fat droplets in adipocvte were stained by red-oil-O(×200)

3 討論

維甲酸對(duì)哺乳動(dòng)物脂肪代謝的生化過程包括脂肪細(xì)胞分化、適應(yīng)性熱代謝、脂肪酸氧化分解等有重要影響。嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)維甲酸有減輕體質(zhì)量，升高體溫，提高胰島素敏感性，促進(jìn)脂肪分解的作用，并且可以促使棕色脂肪組織和骨骼肌表達(dá)UCP1。t-RA 具有促進(jìn)細(xì)胞分化的作用，對(duì)細(xì)胞內(nèi)外離子分布、細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸攝取和蛋白質(zhì)合成代謝酶的表達(dá)都有影響。本實(shí)驗(yàn)將t-RA 以不同濃度作用于小鼠白色脂肪細(xì)胞24 h，檢測UCP1 mRNA 及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，t-RA 可以促使小鼠白色脂肪細(xì)胞表達(dá)UCP1 即促使白色脂肪細(xì)胞發(fā)生棕色化。但t-RA促使白色脂肪組織發(fā)生“棕色化”的機(jī)制仍未明確。有研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用過氧化物酶體增殖物激活受體α (peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPARα)激動(dòng)劑不能促使“棕色化”的發(fā)生，除非聯(lián)合使用維甲酸，同時(shí)認(rèn)為PPARα促使“棕色化”的發(fā)生有可能前提需激活有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)［3］。那么t-RA促使小鼠白色脂肪棕色化是否是因?yàn)榧せ盍薓APKs 信號(hào)通路，這些信號(hào)通路的激活是否是“棕色化”發(fā)生的必要條件，這有待進(jìn)一步探索。

圖4 不同濃度全反式維甲酸處理的小鼠脂肪細(xì)胞UCP1 蛋白的表達(dá)水平Fig 4 Expression levels of UCP1 protein in mice adipocytes after treatment with t-RA at various concentrations

表1 RT-PCR 及Western blot 檢測不同濃度全反式維甲酸處理的小鼠脂肪細(xì)胞UCP1 mRNA 及蛋白的表達(dá)Table 1 RT-PCR and Western blot showed that expression levels of UCP1 mRNA and protein in mice adipocytes after treatment with t-RA at various concentrations (±s，n=3)

表1 RT-PCR 及Western blot 檢測不同濃度全反式維甲酸處理的小鼠脂肪細(xì)胞UCP1 mRNA 及蛋白的表達(dá)Table 1 RT-PCR and Western blot showed that expression levels of UCP1 mRNA and protein in mice adipocytes after treatment with t-RA at various concentrations (±s，n=3)

＊P＜0.01 compared with blank control group.

group0(blank control)10 －510 －410 －310 －210－1 UCP1 mRNA00.49 ±0.014*0.68 ±0.019*0.33 ±0.018*0.23 ±0.008*0.26 ±0.014*UCP1 protein00.31 ±0.014*0.39 ±0.013*0.25 ±0.017*0.28 ±0.013*0.23 ±0.016*

［1］Jorge Ivan Castillo-Quan.From white to brown fat through the PGC-1α-dependent myokine irisin:implications for diabetes and obesity［J］.Dis Model Mech，2012，5:293 －295.

［2］J.Mercader，J.Ribot，I.Murano，et al.Haploinsufficiency of the retinoblastoma protein gene reduces diet-induced obesity，insulin resistance，and hepatosteatosis in mice［J］.Endocrinol.Metab，2009，297，184 －193.

［3］Guillaume E.Beranger，Michael Karbiener，Valentin Barquissau，et al.In vitro brown and“brite”/“beige”adipogenesis:Human cellular models and molecular aspects［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2012，104:7 －18.