孟智超，李淑玲，肖建英*

(遼寧醫(yī)學院基礎醫(yī)學院1.生物化學與分子生物學教研室;2.組織學與胚胎學教研室，遼寧錦州121001)

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的疾病，其發(fā)病隱蔽，許多卵巢癌被診斷時已經(jīng)是晚期，導致患者生存率下降，嚴重威脅婦女的生命和健康［1］。目前卵巢癌的治療方法為以手術治療為主，化學藥物治療為輔的的綜合治療。紫杉醇聯(lián)合鉑類化療己成為卵巢癌標準的一線化療方案，然而對化療的獲得性耐藥是卵巢癌患者治療失敗和死亡的主要原因，嚴重限制了紫杉醇的應用和療效［2］。大黃素(emodin)是從大黃、虎杖等藥物中提取的游離型蒽醌類成分，研究表明大黃素具有誘導腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞轉移等多種生物學效應，其抗腫瘤作用逐漸受到人們的重視［3-5］。本實驗研究了大黃素對卵巢癌SKOV3 細胞的增殖和凋亡影響，對大黃素在卵巢癌腫瘤治療中的應用具有重要參考價值，為進一步研究卵巢癌化療耐藥的相關機制和提高療效及改善預后具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

大黃素(Sigma 公司);胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)液(Gibco 公司);Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(Bipec 公司);羊多抗Survivin、兔多抗XIAP和鼠單抗β-actin 抗體(Santa Cruz 公司);HRP 標記的山羊抗兔，抗鼠IgG 和鼠抗山羊IgG (北京中杉金橋生物技術有限公司);RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0 試劑盒(Takara 公司);ECL 化學發(fā)光試劑盒(Piece Biotechnology 公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組

人卵巢癌細胞SKOV3(北京市腫瘤研究所)，培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。當細胞處于對數(shù)生長期時，0.25%胰蛋白酶消化傳代，以1 ×105/mL 濃度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后分組給予藥物處理:對照組DMSO;12.5、25 和50 μmol/L 大黃素組。

1.3 MTT檢測細胞增殖活性

胰蛋白酶消化處于對數(shù)增殖期的SKOV3 細胞并制成單細胞懸液，以細胞103/孔接種于96 孔板，每孔200 μL。細胞貼壁后分別給予不同濃度的藥物處理24 h。每組設6 個復孔，棄上清，換等量無血清DMEM，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)37 ℃繼續(xù)孵育4 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩15 min，使甲攢充分溶解。選擇490 nm 波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值，參比波長為630 nm，計算各組細胞增殖率。細胞增殖率=1 －(對照組A 值－ 實驗組A 值)/對照組A 值×100%，每組實驗重復3 次。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

取對數(shù)增殖期的SKOV3 細胞株接種于細胞培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后加入不同濃度的大黃素干預SIRT1 的活性，上述細胞在含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰蛋白酶-EDTA 消化離心細胞，PBS 洗滌2 次;加入FITC-annexin 和100 μg/mL PI染液重懸細胞至單細胞懸液，室溫孵育15 min，將各組細胞進行流式細胞術檢測，CellQuest 分析軟件分析各組細胞期凋亡率。

1.5 RT-PCR 方法檢測Survivin 和XIAP mRNA表達水平

采用Trizol 一步法提取加藥處理24 h 的SKOV3細胞總RNA，并測定RNA 濃度。按TaKaRa RNA PCR(AMV)Ver3.0 試劑盒說明書進行反轉錄和PCR。PCR 引物序列Survivin(5'-CCAAGGTCTGG CTCGTTCTCATG-3'，5'-GCGCACTTTCTCCGCAGTTT C-3'，357 bp);XIAP(5'-GTGATCGTGCCTGGTCAG AA-3'，5'-CAAGGGTCTTCACTGGGCTT-3'，313 bp);β-actin(5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATC TA-3'，5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAG GG-3'，661 bp);PCR 反應條件:94 ℃預變性3 min;94 ℃30 s;55 ℃30 s;72 ℃1 min;35 個循環(huán);72 ℃終延伸7 min。取PCR 產(chǎn)物10 μL 進行瓊脂糖凝膠電泳后拍照，測量吸光度值，mRNA 表達水平以每一樣品與β-actin 吸光度比值表示。

1.6 Western blot 檢測Survivin 和XIAP 的蛋白表達

蛋白裂解液RIPA 提取加藥處理24 h 后的各組細胞總蛋白，測定蛋白濃度，加2 × SDS 樣品緩沖液，煮沸5 min，離心后上樣，10% SDS-PAGE 電泳分離，然后將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST(pH 7.4)將室溫封閉濾膜2 h，濾膜再分別與Survivin 和XIAP(稀釋比1∶500)及β-actin(稀釋比1∶1 000)4 ℃溫育過夜。TBST 洗膜3 次后，HRP 偶聯(lián)的IgG 作為二抗(稀釋比1∶5 000)室溫溫育2 h，洗膜3 次后，ECL 發(fā)光法顯色。Image J分析密度，計算吸光值，內(nèi)參采用β-actin。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大黃素對卵巢癌細胞系SKOV3 細胞的生長抑制作用

與對照組相比，12.5、25 和50 μmol/L 大黃素分別作用SKOV3 細胞24 h 后，各組細胞增殖率隨著藥物濃度的升高而降低(P＜0.01)(圖1，表1)。

2.2 大黃素誘導SKOV3 細胞的細胞凋亡

與對照組相比，大黃素各組細胞凋亡率較對照組顯著增加(P＜0.01)(圖2，表1)。

2.3 大黃素抑制SKOV3 細胞中Survivin 和XIAP mRNA 表達

與對照組比較，大黃素作用于SKOV3 細胞后，Survivin 和XIAP 的mRNA 表達明顯降低，且隨劑量增加表達越低(P＜0.01)(圖3，表2)。

圖1 不同濃度大黃素(0、12.5、25 和50 μmol/L)作用SKOV3 細胞的細胞增殖率變化Fig 1 The SKOV3 cells proliferation rate in the presence of different concentration of emodin(±s，n=3)

表1 不同濃度大黃素(0、12.5、25 和50 μmol/L)對SKOV3 細胞增殖和凋亡影響Table 1 The proliferation rate and apoptosis rate of SKOV3 cells in the presence of different concentration of emodin (±s，%，n=3)

表1 不同濃度大黃素(0、12.5、25 和50 μmol/L)對SKOV3 細胞增殖和凋亡影響Table 1 The proliferation rate and apoptosis rate of SKOV3 cells in the presence of different concentration of emodin (±s，%，n=3)

＊P＜0.01 compared with control group.

groups(emodin μmol/L)proliferation rateapoptosis rate control98.92 ±4.341.52 ±0.01 12.590.53 ±4.12*6.38 ±0.56*2573.23 ±2.31*20.33 ±2.22*5049.89 ±2.33*34.68 ±3.81*

圖2 不同濃度大黃素(0、12.5、25 和50 μmol/L)作用SKOV3 細胞后引起細胞凋亡Fig 2 The SKOV3 cells apoptosis in the presence of different concentration of emodin

表2 SKOV3 細胞經(jīng)emodin(0、12.5、25 和50 μmol/L)處理后Survivin 和XIAP 的mRNA 和蛋白表達Table 2 mRNA and protein expression levels of Survivin and XIAP in SKOV3 cells in the presence of different concentration of emodin (±s，n=3)

表2 SKOV3 細胞經(jīng)emodin(0、12.5、25 和50 μmol/L)處理后Survivin 和XIAP 的mRNA 和蛋白表達Table 2 mRNA and protein expression levels of Survivin and XIAP in SKOV3 cells in the presence of different concentration of emodin (±s，n=3)

＊P＜0.01，compared with control group.

group(emodin μmol/L)Survivin mRNAXIAP mRNASurvivin proteinXIAP protein control0.438 ±0.0090.533 ±0.0070.532 ±0.0110.624 ±0.008 12.50.321 ±0.0050.419 ±0.003*0.032 ±0.005*0.443 ±0.008*250.211 ±0.005*0.204 ±0.004*0.026 ±0.005*0.033 ±0.004*500.124 ±0.003*0.103 ±0.002*0.011 ±0.003*0.018 ±0.004*

2.4 大黃素抑制SKOV3 細胞中Survivin 和XIAP的蛋白表達

與對照組比較，各劑量大黃素作用SKOV3 細胞后Survivin 和XIAP 的蛋白表達明顯降低，且隨劑量增加表達越低(P＜0.01)(圖4，表2)。

圖3 不同濃度大黃素作用SKOV3 細胞后Survivin和XIAP 的mRNA 表達Fig 3 The Survivin and XIAP mRNA expression levels in SKOV3 cells

圖4 不同濃度大黃素作用SKOV3 細胞后Survivin和XIAP 的蛋白表達Fig 4 The Survivin and XIAP protein expression levels in SKOV3 cells

3 討論

近年來，對大黃素及其衍生物的性能及藥理研究逐步從傳統(tǒng)的免疫領域擴展到腫瘤治療領域，探究其對腫瘤細胞的抑制作用機理己取得一定進展［4］。研究證明大黃素可以抑制多種腫瘤細胞的生長和增殖，在乳腺癌［6］、卵巢癌［2］、頭頸部癌［7］、胃癌［8］、肝癌［9-10］和前列腺癌［11］中，大黃素明顯抑制腫瘤細胞生長。MTT 法結果表明大黃素對卵巢癌細胞具有濃度依賴性生長抑制作用［2］。體外研究表明，大黃素可誘導多種腫瘤細胞的凋亡效應，通過不同的凋亡途徑來發(fā)揮作用［6，8-10］。IAP 家族(inhibitor of apoptosis protein，IAP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類細胞內(nèi)凋亡抑制蛋白。Survivin 和XIAP 是IAPs家族的兩個重要成員，可分別通過腫瘤壞死因子受體介導的信號傳導途徑和caspases 蛋白酶激活級聯(lián)反應途徑調(diào)控細胞周期進而抑制細胞凋亡［12-13］。Survivin 具有抑制凋亡和調(diào)節(jié)細胞增殖雙重作用［1，14］。Survivin 在機體內(nèi)的表達受到嚴格調(diào)控，胚胎組織中表達，分化成熟的組織中幾乎不表達。但是當細胞惡變?yōu)槟[瘤細胞時，Survivin 又將重新表達。XIAP 作為一個有力的凋亡抑制因子，在許多惡性腫瘤細胞系中過表達，是評估腫瘤惡性程度及預后的一個重要指標［12-13］。本研究進一步檢測了大黃素對SKOV3 細胞的凋亡影響，結果顯示大黃素可以促進卵巢癌SKOV3 細胞凋亡，降低Survivin 和XIAP mRNAs 和蛋白表達水平。本研究結果提示大黃素誘導凋亡可能與抑制Survivin 和XIAP 表達密切相關［12］。

綜上所述，大黃素可以抑制SKOV3 細胞的增殖和誘導細胞凋亡，具有濃度依賴性，其機制可能通過抑制凋亡抑制蛋白Survivin 和XIAP 表達有關。因此，研究卵巢癌發(fā)生發(fā)展機制，對制定卵巢癌合理有效的綜合治療方案及改善預后和提高患者的生活質(zhì)量奠定理論基礎。

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