田 丹，桑力維，于 夕，Chung Wookjin，于景成

（1.北京昊業(yè)怡生科技有限公司，北京 100093；2.明知大學(xué)能源科學(xué)與技術(shù)系，韓國 449728）

糞便污水中COD、N、P濃度較高，糞便污水處理不同工藝階段中，微藻生長所需的N、P和其他營養(yǎng)元素的含量呈現(xiàn)不同的濃度水平，為微藻提供了更多選擇的培養(yǎng)基資源。因此，研究如何利用城市糞便污水培養(yǎng)產(chǎn)油微藻，實現(xiàn)糞便污水深度凈化和產(chǎn)油微藻低成本大規(guī)模培養(yǎng)，達到凈化水質(zhì)的同時實現(xiàn)清潔能源生產(chǎn)的效果，對緩解能源短缺和環(huán)境污染問題具有重要的現(xiàn)實意義。筆者選擇已報道的幾種油脂含量較高的微藻，利用糞便污水馴化培養(yǎng)，從中篩選出能夠適應(yīng)城市糞便污水環(huán)境的產(chǎn)油微藻。開展了利用不同處理階段的糞便污水培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的條件研究，探討糞便污水處理和產(chǎn)油微藻生產(chǎn)工藝的耦合的可行性。確定了利用糞便污水培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的最佳條件和微藻培養(yǎng)對糞便污水的凈化效果。為利用糞便污水大規(guī)模生產(chǎn)產(chǎn)油微藻，降低微藻生物柴油成本奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

1） 藻種：小球藻-1 （Chlorella vulgaris）、布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）購于中國科學(xué)院水生生物研究所藻種庫，小球藻-2（Chlorella vulgarisAG10032）、四尾柵藻 （Scenedesmus guadricauda）由韓國明知大學(xué)提供。

2） 培養(yǎng)基：蒸餾水配制的BG11培養(yǎng)基［1］，取自糞便處理站不同處理階段出水的污水培養(yǎng)基。其中UASB出水是指固液分離后的糞便污水經(jīng)過升流式厭氧污泥床處理后的污水，MBR出水是UASB出水經(jīng)過缺氧/好氧/膜生物反應(yīng)器處理后的污水。糞便污水培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后使用。

3） 設(shè)備：DT5-1型低速自動平衡離心機、LRH-250型生化培養(yǎng)箱、752型紫外可見分光光度計、XSZ-H顯微鏡、VS型潔凈實驗臺和RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器等。

1.2 方法

1.2.1 微藻培養(yǎng)

實驗在溫度可調(diào)恒溫培養(yǎng)室中進行。采用錐形瓶作為藻種培養(yǎng)的反應(yīng)器，錐形瓶用可透過空氣的無菌封口膜包扎。以三基色熒光燈作為光源，光強的控制通過開啟熒光燈的數(shù)量確定。微藻培養(yǎng)的初始吸光度0.1左右，每天搖動3次通入空氣補充CO2。

1.2.2 微藻藻種的馴化

用蒸餾水稀釋5倍的UASB出水與BG11標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基1∶1混合，作為藻種的初始馴化培養(yǎng)基，以BG11標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基作為對照。分別向250 mL錐形瓶中裝入100 mL培養(yǎng)基，再接入微藻。培養(yǎng)溫度25℃，光照強度3 000 lx，光暗周期12 h∶12 h。實驗過程中每2 d取樣測定OD685nm，分析微藻細(xì)胞生長情況。

用UASB出水、MBR出水對初始馴化藻種進行二次馴化，以上述方法中的初始馴化培養(yǎng)基為對照，分別向1 L錐形瓶中接入600 mL培養(yǎng)基，再接入初始馴化后藻種。其余條件同上。

1.2.3 不同溫度的影響

分別使用UASB出水和MBR出水培養(yǎng)馴化后微藻，初始吸光度0.1左右。將微藻培養(yǎng)液分別放置于溫度為15、20、25、30、35℃，光照強度3 000 lx，光暗周期12 h∶12 h條件下，測定微藻生長情況。

1.2.4 不同光照強度的影響

分別使用UASB出水和MBR出水培養(yǎng)馴化后微藻。將微藻培養(yǎng)液分別放置于光強為 1 500、3 000、4 500、6 000、8 000、10 000 lx，溫度為25℃，光暗周期12 h∶12 h條件下，測定微藻生長情況。

1.2.5 污水凈化效果

分別使用UASB出水和MBR出水在1.2.3和1.2.4中得到的最佳條件下培養(yǎng)馴化后微藻。為避免微藻進入衰亡期后，細(xì)胞破碎，營養(yǎng)物質(zhì)溶出影響實驗結(jié)果，本實驗一次性培養(yǎng)6 d。將培養(yǎng)前后的藻液在4 000 r/min離心15 min，取上清液檢測水質(zhì)指標(biāo)。

1.2.6 油脂提取

將按照1.2.5方法培養(yǎng)離心后的藻種收集，使用石英砂研磨破碎，采用索氏提取法進行油脂提取和含量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 微藻藻種的馴化和選擇

有研究表明，為使自然界微藻適應(yīng)高濃度污水環(huán)境，需以一定比例的污水與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)培育基混合，對微藻進行初期的馴化培養(yǎng)［2］。通過對不同處理階段的糞便污水的成分和BG11標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的成分進行對比分析發(fā)現(xiàn)，UASB出水稀釋5倍后，其總氮和總磷含量與BG11標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基相似。因此選擇用蒸餾水稀釋5倍的UASB出水按照1.2.2的方法對微藻進行初始馴化培養(yǎng)。由圖1可知，在最初5～8 d，幾種微藻的生長在糞便污水環(huán)境中有所抑制，處于適應(yīng)期，小球藻-1在第6天，四尾柵藻在第8天開始快速增殖。而小球藻-2和布朗葡萄藻對糞便污水環(huán)境的適應(yīng)能力較差。本研究選擇初始馴化后的小球藻-1和四尾柵藻進行后續(xù)實驗。小球藻-1和四尾柵藻在UASB出水、MBR出水中培養(yǎng)的結(jié)果顯示，糞便污水對小球藻-1和四尾柵藻的生長有明顯促進作用，在營養(yǎng)更為豐富的UASB出水中兩種微藻均能迅速積累生物量。同時，糞便污水也一定程度上延緩了微藻細(xì)胞衰亡，尤其是小球藻在BG11標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中第4～6天生長減緩，進入衰亡期。而在糞便污水中第8天OD才開始緩慢降低。到培養(yǎng)的第12天時，小球藻-1在UASB出水培養(yǎng)液中的吸光度為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的2.89倍，表現(xiàn)出顯著差異。UASB出水、MBR出水均可以作為培養(yǎng)小球藻-1和四尾柵藻的優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基。

圖1 不同培養(yǎng)基中微藻的生長情況

2.2 不同溫度對污水中微藻生長情況的影響

有文獻指出，溫度是影響微藻生長和繁殖的重要環(huán)境因子之一，微藻的生長和產(chǎn)物的合成都是在各種酶催化下進行的［3］。溫度對微藻的生長和發(fā)育有調(diào)節(jié)作用，對酶的活性、營養(yǎng)物的吸收利用效率及細(xì)胞分裂的周期等諸多方面都存在不同程度的影響，溫度通過控制有關(guān)酶的活性來影響其生長，也可能是由于使細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離而影響正常細(xì)胞的生命活力。在適宜溫度范圍內(nèi)，溫度升高時細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)和酶促反應(yīng)都以較快的速度進行，藻的生長也會越來越快，但是超過一定溫度后，細(xì)胞組分、蛋白質(zhì)和核酸會受到不可逆的損害，這樣的損害是化學(xué)性的，這時細(xì)胞機能急劇下降到零。相反當(dāng)溫度降低時，細(xì)胞新陳代謝的化學(xué)反應(yīng)速率會減慢［4］。本研究對利用糞便污水培養(yǎng)的小球藻-1和四尾柵藻在不同溫度條件下的生長情況進行了觀察對比。

由圖2可知，在25℃下，小球藻-1和四尾柵藻的吸光度較高，生長速率較快，25℃是適宜UASB出水培養(yǎng)微藻的最佳溫度。不同溫度條件下MBR出水中培養(yǎng)微藻的生長情況與UASB出水的結(jié)果一致。

圖2 溫度對UASB出水中微藻生長情況的影響

實驗結(jié)果表明，除最適生長溫度25℃之外，小球藻和四尾柵藻在糞便污水中對溫度的耐受范圍比較廣。糞便污水產(chǎn)業(yè)化處理過程中UASB出水和MABR出水溫度在15℃以上，可直接用于微藻培養(yǎng)。

2.3 不同光強對污水中微藻生長情況的影響

本研究對不同光強下，小球藻-1和四尾柵藻在UASB污水和MBR污水培養(yǎng)基中的生長情況的對比觀察結(jié)果表明，糞便污水中的小球藻-1和四尾柵藻對光照強度的耐受范圍比較廣，在1 500～10 000 lx均可生長，1 500 lx時生長較緩慢。相對而言，污水中小球藻-1比較耐高光強。歐陽崢嶸等［5］研究表明，藻類對光照強度有1個飽和點，低于光飽和點，隨著光強的增加，藻類的光合速率加快；超過光飽和點，藻類的光合速率不再增加，甚至減弱、停止。還有研究發(fā)現(xiàn)［6］，在適宜的光強范圍內(nèi)，光輻射能可以被微藻充分利用而以熱能形式耗散的量較少，光照強度增強會使微藻的光合電子傳遞速率和光合速率增高，促進微藻的生長和生物量積累。相反，當(dāng)光強超過微藻的適宜光強范圍時，微藻對光能的熱耗散增加，并且熱耗散的強度隨光強的升高而升高［7］。因此，當(dāng)光強較高時，光照強度的進一步升高并不一定會相應(yīng)地使微藻的光合速率增高、生長加強，過量光能會以熱耗散的形式消耗掉而不能用于光合生產(chǎn)。

由圖3可知，在UASB出水和MBR出水培養(yǎng)基中，小球藻-1的光飽和點為8 000 lx，四尾柵藻的光飽和點為6 000 lx。在此光照強度下，兩種微藻的生長情況最好。

圖3 不同光強對UASB出水中微藻生長情況的影響

2.4 微藻對污水的凈化效果

國內(nèi)外的研究表明，微藻對于市政污水、剩余污泥中的氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)有凈化效果［1-2，8-9］。小球藻-1和四尾柵藻對UASB出水和MBR出水凈化效果的數(shù)據(jù)顯示，小球藻-1和四尾柵藻對UASB出水中總氮的去除率分別為9.88%和13.51%，總磷去除率分別為89.23%和72.45%，CODCr去除率分別為59.91%和69.31%。而對MBR出水，兩種微藻都表現(xiàn)為對氮磷的去除效果顯著，而對CODCr沒有去除效果，反而培養(yǎng)后CODCr略有增加。這是因為UASB出水中的CODCr為微生物易于利用的小分子有機物，而MBR出水中的CODCr多為微生物碎片，MBR出水培養(yǎng)微藻后，液體中存在少量微藻細(xì)胞碎片，造成MBR出水中CODCr升高。本實驗結(jié)果顯示，小球藻-1和四尾柵藻能利用糞便污水中的氮磷，有效凈化污水水質(zhì)，降低糞便污水處理下游工序的處理負(fù)荷，見圖4。

圖4 微藻對糞便污水中污染指標(biāo)的去除效果

2.5 糞便污水培養(yǎng)微藻的含油率測定

利用糞便污水培養(yǎng)的產(chǎn)油微藻的含油量的實驗結(jié)果顯示，兩種微藻在MBR出水培養(yǎng)條件下的油脂含量均高于普通條件，而UASB出水培養(yǎng)條件下油脂含量比普通培養(yǎng)條件下低。UASB出水培養(yǎng)的小球藻-1含油率為25.68%，MBR出水培養(yǎng)含油率為35.54%，BG11標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)為35.54%。四尾柵藻在UASB出水培養(yǎng)中含油率為22.61%，MBR出水中含油率為33.50%，BG11標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下為30.90%。分析差異是由于產(chǎn)油微藻在逆境條件下積累脂類，在諸多影響微藻生物量和脂肪含量的因素中，氮元素影響最為明顯，在氮缺乏的條件下，微藻積累油脂。由此可見，如果考慮油脂產(chǎn)率，由糞便污水處理后的MBR出水培養(yǎng)的產(chǎn)油微藻含油率較高，可進行大規(guī)模培養(yǎng)。

3 結(jié)論

1）本研究表明產(chǎn)油微藻小球藻-1和四尾柵藻可利用經(jīng)機械和生物處理后的城市糞便污水中的豐富營養(yǎng)成分，在溫度25℃，通過高效的光合作用，吸收糞便污水中的有效物質(zhì)快速增殖生長。

2）微藻在糞便污水中生長時，對污水中的污染指標(biāo)有去除效果，尤其是UASB出水中，氮磷及CODCr含量均顯著降低，可降低糞便污水處理下游工序的處理負(fù)荷。雖然利用UASB出水培養(yǎng)的產(chǎn)油微藻的油脂含量略低于普通培養(yǎng)條件，但是綜合考慮污水處理效果和產(chǎn)油微藻的培養(yǎng)成本，UASB出水是培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的優(yōu)異培養(yǎng)基選擇。

3）本研究得到利用城市糞便污水培養(yǎng)產(chǎn)油微藻的最佳條件，將糞便污水深度處理工藝與微藻生物柴油生產(chǎn)技術(shù)有機結(jié)合起來，以城市糞便污水作為資源進行微藻的規(guī)?；囵B(yǎng)，既節(jié)約了水資源，降低微藻生物產(chǎn)油產(chǎn)業(yè)化發(fā)展中成本過高的問題，又轉(zhuǎn)移和深度凈化了城市糞便污水中的N和P等污染指標(biāo)，有助于減輕水體富營養(yǎng)化，保護水體環(huán)境。本研究成果具有良好的發(fā)展前景和應(yīng)用潛力。

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