甘自立，諶模武，林 紅，李 勇，熊秋迎，劉絲蓀，郭 菲

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.燒傷中心;2.腫瘤科;3.病理科;4.婦產(chǎn)科;5.南昌大學(xué)研究生院;6.南昌縣疾控中心，江西南昌330006)

宮頸癌是發(fā)生在全球婦女中第二大常見的惡性腫瘤，其死亡率已躍居各類婦科惡性腫瘤之首［1］，近年來，宮頸癌的診斷及綜合治療水平取得了很大的進(jìn)展，但其發(fā)病率和死亡率并未發(fā)生根本性的變化，因此對宮頸癌防治的研究必須高度重視。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，也是細(xì)胞護(hù)性因子，可上調(diào)“保護(hù)性或抗凋亡蛋白”，在腫瘤發(fā)生過程中可提高腫瘤細(xì)胞生存率，抑制細(xì)胞凋亡［2］。大量研究表明宮頸癌中存在NF-κB 的組成式激活［3］，然而癌旁組織作為重要的腫瘤微環(huán)境，其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量和免疫組化的方法，研究癌旁組織中是否存在NF-κB 信號通路的活化，探討NF-κB信號通路在宮頸癌發(fā)生的早期分子事件中所起的作用，可否成為宮頸癌預(yù)防治療的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠源性宮頸癌細(xì)胞系U14(江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所)，清潔級昆明小鼠，雌性，5 ～7 周齡，20 ～22 g，32 只［南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部，合格證號:贛(動)-96021］。

1.2 主要試劑

miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa 公司);PCR Master Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司);Trizol試劑(Invitrogen 公司);HRP 標(biāo)記Ⅱ抗;NF-κB(P65)I 抗(中杉金橋公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠U14 宮頸癌移植腫瘤模型的建立:取小鼠U14 宮頸癌細(xì)胞懸液接種于2 只小鼠腹腔，2 周后急性頸椎脫臼處死腹水飽滿的小鼠，抽取乳白色腹水為瘤源，錐蟲藍(lán)檢測細(xì)胞成活率大于95%后調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107/mL，向30 只小鼠右側(cè)腋窩皮下接種細(xì)胞懸液，每只0.2 mL。接種后每日觀察小鼠的生活習(xí)性及成瘤情況。待瘤塊直徑大小為1.5 cm ×1.5 cm時(shí)(約15日后)，將其急性頸椎脫臼處死，取癌組織與距離癌組織2 cm以上的癌旁組織，以及正常的脂肪組織于EP 管中，儲存于－80 ℃冰箱備用。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測miR-15b 和miR-16的表達(dá):利用Trizol 試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄參照miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，在冰上操作。按照說明書配制反應(yīng)液，反應(yīng)條件參照說明書。所得cDNA 于冰上分裝，置于－80 ℃冰箱。構(gòu)建miR-15b、miR-16 和U6 的實(shí)時(shí)定量反應(yīng)體系(總反應(yīng)體系20 μL)，置于ABI 7500 PCR 儀中擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下:95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃32 s，加融解曲線，40 個(gè)循環(huán)，于72 ℃32 s收集數(shù)據(jù)。同時(shí)設(shè)無模板對照及水的對照。由于實(shí)時(shí)定量PCR 靈敏度較高，每個(gè)標(biāo)本做3 個(gè)復(fù)管。

1.3.3 PCR 產(chǎn)物的相對定量分析:采用U6 作為內(nèi)參，用它的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，通過SDS 軟件獲得各樣本的miR-15b 和miR-16 的Ct 值，與同樣本中U6 的Ct 值相減，得到ΔCt 值，用正常脂肪組織的ΔCt 值作為校正，得到－ΔΔCt值，用公式2－ΔΔCt計(jì)算各樣本中miR-15b 和miR-16 的表達(dá)量。

1.3.4 免疫組化檢測NF-κB(P65)蛋白在各組織中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的表達(dá):將各組織切片行HE 染色診斷和免疫組化分析。石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，微波修復(fù)抗原。1%胎牛血清封閉10 min，吸干封閉液，加入NF-κB (P65)I 抗(濃度1∶100)，4 ℃過夜，0.01 mol/L PBS 洗滌。隨后加入1∶100 辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min PBS 洗滌，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封固。在資深病理科醫(yī)生指導(dǎo)下進(jìn)行結(jié)果的分析判斷，NF-κB(P65)蛋白活化后，主要表達(dá)于胞核，少部分位于胞質(zhì)，處于未活化狀態(tài)時(shí)，則主要表達(dá)于胞質(zhì)。以上部位出現(xiàn)黃色顆粒分布并明顯高于背景著色為陽性。結(jié)果判定引用參考文獻(xiàn)［4］的方法，每張切片選取5 個(gè)高倍鏡視野，分別計(jì)數(shù)每一視野中陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)。5 個(gè)視野陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)之平均數(shù)為該例陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的結(jié)果。測定免疫組化反應(yīng)陽性顆粒的平均吸光度A 值，對NF-κB(P65)蛋白的表達(dá)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析(ANOVA)和t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 成功建立小鼠腹水瘤模型和皮下移植瘤模型

約15 d后，肉眼可見明顯皮下移植瘤，大小約1.5 cm×1.5 cm，成瘤率100%，HE 染色見宮頸癌移植瘤細(xì)胞浸潤皮下脂肪生長(圖1)。

圖1 小鼠宮頸癌移植瘤模型Fig 1 The xenograft mouse model of cervical cancer

2.2 miR-15b和miR-16 在癌組織及癌旁組織高表達(dá)

圖2 為miR-15b、miR-16 和U6 在各組織的溶解曲線，呈單峰說明實(shí)驗(yàn)特異性較好。miR-15b 在宮頸癌組織中表達(dá)為32.21 ±3.67，高于癌旁組織的25.16 ±1.86 和正常組織(P＜0.05)，癌旁組織也顯著高于正常組織(P＜0.05);miR-16 在宮頸癌組織中表達(dá)為28.63 ±2.34，高于癌旁組織的22.16 ±1.76 和正常組織(P＜0.05)，癌旁組織也顯著高于正常組織(P＜0.05)(圖3)。

圖2 miR-15b、miR-16 和U6 在各組織的溶解曲線Fig 2 The dissociation curve of miR-15b，miR-16 and U6 in tissues

圖3 宮頸癌組織和癌旁組織中miR-15b 和miR-16的表達(dá)情況Fig 3 The expression of miR-15b and miR-16 in cervical cancer tissues and adjacent nontumorous tissues

2.3 免疫組化檢測NF-κB(P65)蛋白在各組織中表達(dá)和定位

NF-κB(P65)亞單位免疫組化陽性產(chǎn)物位于胞核/胞質(zhì)，呈棕褐色細(xì)顆粒狀，結(jié)果:陰性對照組的胞核/胞質(zhì)無棕黃染色(圖4D)。在正常脂肪組織標(biāo)本中，NF-κB(P65)蛋白主要定位于胞質(zhì)，見少數(shù)核著色(圖4C)，30 例正常組織標(biāo)本中胞核陽性表達(dá)率為10%。而在宮頸癌旁組織與癌組織中，NFκB(P65)蛋白主要位于胞核，少部分位于胞質(zhì)(見圖4A、B)。30 例癌組織標(biāo)本中核陽性表達(dá)率為89%，30 例癌旁組織標(biāo)本中核陽性表達(dá)率為80%。癌組織中NF-κB(P65)吸光度A 值為0.431 ±0.008，明顯高于癌旁組的0.283 ±0.006 和正常組的0.101±0.002(P＜0.05)，癌旁組NF-κB(P65)吸光度A值也明顯高于正常組織(P＜0.05)。

3 討論

宮頸癌的發(fā)生已呈年輕化趨勢，大量的分子研究認(rèn)為是多基因改變而積累的結(jié)果。miRNA 作為原癌基因或者抑癌基因，在腫瘤的惡變機(jī)制中受表觀遺傳學(xué)的調(diào)控［5］。由此，miRNA 在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中所起的作用受到了人們的關(guān)注。對121 例宮頸癌患者的標(biāo)本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HPV 整合位點(diǎn)附近有53 個(gè)miRNA 基因，出現(xiàn)頻率為78.3%［6］，其中25 個(gè)曾被報(bào)道出現(xiàn)在宮頸癌組織中，利用miRNA芯片結(jié)合Nothenblot 技術(shù)檢測7 對年齡匹配的宮頸癌組織和正常宮頸組織中455 個(gè)成熟miRNA，結(jié)果顯示miR-15b，miR-16 在宮頸癌組織中高表達(dá)。

圖4 宮頸癌及癌旁組織中NF-κB(P65)的表達(dá)與定位Fig 4 The expression and sublocation of NF-κB(P65)in cervical cancer tissues and adjacent nontumorous tissues(×200)

miR-15b 和miR-16 在調(diào)控細(xì)胞生理活動的同時(shí)，也參與了引起疾病發(fā)生的多條信號通路，NF-κB信號通路就在其中。NF-κB 蛋白家族由兩個(gè)亞家族組成:Rel 蛋白和NF-κB 蛋白，其中研究較多的是NF-κB(P65)蛋白，它是基因轉(zhuǎn)錄的激活物［2］。在宮頸癌組織和細(xì)胞系，均發(fā)現(xiàn)存在NF-κB 高表達(dá)與激活，NF-κB 通路在宮頸癌中起到抗凋亡和保護(hù)細(xì)胞的作用［7］。同時(shí)，NF-κB 通路的激活參與調(diào)控miRNA 的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，受到棒狀桿菌感染的膽管上皮細(xì)胞通過激活NF-κB 信號通路來調(diào)節(jié)miRNA 的表達(dá)，其中，miR-15b 和miR-16 的高表達(dá)與其結(jié)合在NF-κB 的潛在啟動子區(qū)域有關(guān)［8］。在胃癌細(xì)胞中利用NF-κB 抑制劑下調(diào)NF-κB 表達(dá)的同時(shí)，miR-16 的表達(dá)也降低了［9］，說明NF-κB 靶向調(diào)控miR-16，miR-16 通過反饋環(huán)調(diào)節(jié)NF-κB 的非經(jīng)典途徑。芯片分析也證明了NF-κB 的結(jié)合區(qū)位于miR-16 的啟動子上。

NF-κB 信號通路在宮頸癌組織的研究較多，而癌旁組織作為腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的微環(huán)境卻研究較少。本實(shí)驗(yàn)miR-15b 和miR-16 在癌旁組織中高表達(dá)，癌旁組織的NF-κB 通路處于活化狀態(tài)，考慮miR-15b和miR-16 作為NF-κB 調(diào)控的下游基因，在癌旁組織中的高表達(dá)與NF-κB 通路的活化有關(guān)，因此NF-κB信號通路是宮頸癌發(fā)生的早期分子事件，推測NF-κB 抑制劑的應(yīng)用將對腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移提供新的預(yù)防治療手段，抑制NF-κB 活性的治療手段也可作為當(dāng)前治療的補(bǔ)充［10］。本實(shí)驗(yàn)僅局限于動物模型，臨床應(yīng)用的推廣還需收集不同分期的臨床標(biāo)本，根據(jù)其分化程度、病理分級、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移的不同，進(jìn)一步驗(yàn)證NF-κB 信號通路對宮頸癌早期發(fā)生發(fā)展的影響及可提供的預(yù)防治療手段。

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