牛麗靜，白 云，管振龍，宋俊貞，苗智慧，夏曉紅，王燕凌，王惠娟

(1.河北省疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學(xué)研究所，河北石家莊050021;2.唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖教研室，河北唐山063000;3.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院神經(jīng)生理學(xué)教研室，河北石家莊050024;4.河北省血液中心臨床輸血技術(shù)指導(dǎo)辦公室，河北石家莊050071)

利鈉肽主要通過激活NPR-A(natriuretic peptide receptors A)或NPR-B(natriuretic peptide receptors B)受體，完成利尿、降壓、調(diào)節(jié)神經(jīng)、促進骨骼發(fā)育等功能，特別在調(diào)控心腎功能以維持機體穩(wěn)態(tài)過程中起重要作用［1］。另一種受體NPR-C(natriuretic peptide receptors C)，被認(rèn)為是可以從循環(huán)中清除利鈉肽的受體。利鈉肽受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，特別在下丘腦、腦干及室周器官有密集表達，在中樞調(diào)控心血管穩(wěn)態(tài)過程中亦起著重要的作用［2-4］。孤束核是接受并整合心血管傳入沖動的初級中樞，其內(nèi)的膽堿能和兒茶酚胺能神經(jīng)元參與了血壓調(diào)節(jié)［5］?，F(xiàn)已知孤束核內(nèi)存在有NPR-A 和NPR-C 陽性神經(jīng)元，但這些神經(jīng)元是否為膽堿能或兒茶酚胺能神經(jīng)元?在心肌缺血后，孤束核區(qū)域的NPR-A、NPR-C 的表達量是否隨之發(fā)生變化?這些均未見報道。本研究擬通過檢測NPR-A 和NPR-C 的表達變化和NPR-A/TH(或NPR-C/TH)、NPR-A/ChAT(或NPR-C/ChAT)的雙標(biāo)記情況，來探討心肌缺血后利鈉肽在孤束核內(nèi)的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

清潔級3月齡雄性SD 大鼠(體質(zhì)量280 ～330 g，河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證編號:1006015)63 只。兔抗NPR-A 多克隆抗體和兔抗NPR-C 多克隆抗體(Abcom)、山羊抗ChAT 單克隆抗體(Millpore 公司)、小鼠抗TH 單克隆抗體(Sigma公司)、山羊抗小鼠IgG-FITC 和兔抗山羊IgG-FITC(均中杉金橋有限公司)。

1.2 實驗分組及模型復(fù)制

大鼠隨機分為免疫熒光化學(xué)組(3 只)，實驗組(模型組，43 只)，實驗對照組(假手術(shù)組，sham，8只)、對照組(control，9 只)。

免疫熒光化學(xué)反應(yīng)組大鼠經(jīng)4%多聚甲醛灌流固定，取腦組織行冰凍切片，免疫化學(xué)熒光反應(yīng)。給實驗組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，復(fù)制心肌缺血動物模型［6］。大鼠手術(shù)后進行恢復(fù)性飼養(yǎng)。將成活的實驗組大鼠隨機分為3 d 取材組(9 只)，術(shù)后7 d 取材組(7 只)，術(shù)后14 d 取材組(9 只)，術(shù)后18 d 取材組(9 只)和術(shù)后28 d 取材組(9 只)。實驗對照組大鼠除了不結(jié)扎冠狀動脈左前降支外，其他手術(shù)與實驗組的處理相同。對照組大鼠不做手術(shù)處理，正常飼養(yǎng)。

1.3 TTC 染色

從實驗組、假手術(shù)組和對照組取材過程中摘下的心臟的心尖部注入1 mL 3%伊萬氏藍。數(shù)秒后將心臟在4 ℃0.9%氯化鈉注射液中沖洗，濾紙吸干水后－20 ℃保存30 min。隨后把冷凍后的心臟沿房室溝軸橫切成2.0 ～2.5 mm 厚的斷面，用0.1%TTC 0.9%氯化鈉注射液溶液37 ℃孵育30 min。正常組織被染成藍色，缺血心肌組織被染成紅色，梗死區(qū)不著色，以此判定心肌缺血模型是否復(fù)制成功［7］。

1.4 蛋白質(zhì)印跡實驗?zāi)X組織取材

實驗組動物分別在手術(shù)后的第3、7、14、18 和28 天深度麻醉(80 mg/kg)，剪開胸腔，暴露心臟，經(jīng)升主動脈插管，先用100 mL 0.9%氯化鈉注射液沖洗血液。血液沖洗干凈后，迅速摘下心臟，用吸水紙吸干多余水分后稱重;取整腦，在閂平面取孤束核組織(約0.015 g)。將取下的腦組織置于低溫環(huán)境(0 ～4 ℃)備用。實驗對照組大鼠、對照組大鼠于實驗組術(shù)后3 d 按上述方法進行取材處理。

1.5 免疫熒光化學(xué)反應(yīng)

所有切片均采用漂浮染色法:冰凍切片放入漂洗盒，PBS 換洗3 次，然后加入4%牛血清(含0.3%Triton 的PBS 稀釋)室溫封閉40 min;PBS 換洗3次，加入小鼠抗TH 抗體(1∶10 000)/山羊抗ChAT(1∶1 000)、兔抗NPR-A 抗體(1∶600)/兔抗NPR-C(1∶1 600)(用含0.3% Triton 的PBS 稀釋)混合液，振蕩后4 ℃冰箱中孵育72 h;取出后PBS 換洗5 次;加入山羊抗小鼠IgG-FITC(1∶500，用含0.3% Triton的PBS 稀釋)、山羊抗兔IgG-TRITC(1∶1 000，用含0.3% Triton 的PBS 稀釋)混合液，室溫下振蕩孵育4 h;PBS 換洗5 次，切片裱于掛有3%明膠的載玻片上，置于陰涼處避光晾干后，甘油封片。于熒光顯微鏡下觀察并照相，記錄結(jié)果。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析

分別將實驗組、實驗對照組以及對照組大鼠取下的孤束核組織進行處理。低溫下加入RIPA 裂解液研磨成漿液，離心后取上清液，考馬斯亮藍蛋白定量。按照蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線測定組織上清液中的蛋白含量，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(每加樣孔中蛋白上樣量60 μg)之后，將凝膠進行轉(zhuǎn)膜，并進行NPR-A 和NPR-C 的印跡雜交(抗體稀釋濃度為1∶500)以內(nèi)參肌動蛋白(β-actin)條帶吸光度值作為標(biāo)準(zhǔn)，計算NPR-A 和NPR-C 蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

用Image J 圖像分析軟件采集吸光度值，并以SPSS13.0 數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗結(jié)果以算術(shù)平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，進行單因素方差分析，Student Newman-Keuls 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 TTC 染色的結(jié)果

動物心臟呈現(xiàn)深藍色，在冠脈結(jié)扎創(chuàng)口附近可見明顯的紅色缺血區(qū)和白色梗死區(qū)(圖1)。假手術(shù)組動物心肌可見少量紅色區(qū)域?？瞻讓φ战M動物心臟未見紅色缺血區(qū)及白色梗死區(qū)域。提示所有大鼠心肌缺血模型復(fù)制成功。

圖1 TTC 染色結(jié)果及大鼠心臟圖片F(xiàn)ig 1 Photographs of the heart sections after TTC staining and hearts of coronary artery ligation group and sham group(n=6)

2.2 心肌缺血后大鼠心臟的變化

隨心肌缺血時間的延長大鼠心臟明顯肥大，心臟重量也有升高的趨勢，并在術(shù)后14、18 和28 d 比對照組及假手術(shù)組有極顯著的增加。

2.3 孤束核周區(qū)Western blot 的結(jié)果

NPR-A 在相對分子質(zhì)量118 ku 處有明顯陽性條帶，NPR-C 在相對分子質(zhì)量65 ku 處有明顯的陽性條帶(圖2)。心肌梗死后NPR-A 在孤束核周區(qū)的表達呈現(xiàn)一定的波動性，術(shù)后3、7 d 模型組與對照組無顯著性差異，但有逐漸升高的趨勢，在術(shù)后14 d 顯著低于對照組(P＜0.05)，約為其蛋白表達量的1/2，術(shù)后14、18、28 d，NPR-A 的表達亦呈逐漸升高的趨勢，至術(shù)后28 d 顯著高于對照組(P＜0.01)，約為其蛋白表達量的2.4 倍。心肌梗死后NPR-C 在孤束核周區(qū)的表達均低于對照組，3、7、14和18 d 有顯著性差異(P＜0.01)。

2.4 免疫熒光染色的結(jié)果

熒光顯微鏡下，可見孤束核內(nèi)有密集的FITC 標(biāo)記的綠色TH 陽性神經(jīng)元(圖3A、4A)，其中以中小型為主;以及密集的TRITC 標(biāo)記紅色NPR-A 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少量的神經(jīng)元(圖3B)。孤束核中TH/NPR-A 雙標(biāo)記神經(jīng)元呈黃色，有少量散在分布(圖3C)。孤束核內(nèi)還存在有TRITC 標(biāo)記的紅色NPR-C 神經(jīng)元和大量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(圖4B)。TH/NPR-C 雙標(biāo)記神經(jīng)元呈黃色，在孤束核中有密集分布(圖4C)。

圖2 冠脈結(jié)扎后大鼠孤束核周區(qū)NPR-A 和NPR-C 的表達變化Fig 2 NPR-A，NPR-C expression in the nucleus of the solitary tract of the rats after coronary artery ligation

在ChAT 與NPR-A/NPR-C 的雙標(biāo)記熒光化學(xué)實驗中，未發(fā)現(xiàn)有雙標(biāo)記神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分布于孤束核群內(nèi)。

3 討論

心肌缺血后，心室肌和心房肌細(xì)胞增加分泌的利鈉肽與心肌病變的程度呈正相關(guān)［8］?；A(chǔ)實驗研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死模型大鼠的血漿腦鈉肽濃度在第3 天和第14 天有兩次升高［9］。血液中升高的利鈉肽一方面通過抑制腎上腺醛固酮的分泌、降低腎小管細(xì)胞的代謝活動、促進排鈉排水，降低血壓和回心血量;另一方面，利鈉肽可通過無血-腦脊液屏障的部位入腦，作用于不同中樞部位，通過影響激素的分泌和交感、副交感神經(jīng)的活動調(diào)節(jié)心血管的功能。有研究證實，心肌缺血后的心肌組織內(nèi)，心房肽和腦鈉肽的表達均顯著升高，其受體NPR-C 的表達也隨之增多，但于缺血后的第28 天在腎臟和肺內(nèi)顯著降低［10］。本研究結(jié)果孤束核區(qū)域內(nèi)NPR-A 由低到高的表達變化，表明病理條件下利鈉肽在孤束核區(qū)域的調(diào)節(jié)功能，可能主要是通過NPR-A 表達變化實現(xiàn)的。NPR-A 表達的增加可以提高利鈉肽對中樞的作用。本小組以往的研究顯示，心肌缺血后延髓腹側(cè)部NPR-A 的表達顯著升高，與心肌缺血后血液中利鈉肽含量變化的時間點和趨勢一致［11］。提示從無血-腦脊液屏障區(qū)進入中樞的利鈉肽可能先作用于延髓腹側(cè)部升壓區(qū)，適應(yīng)性的升高交感緊張性，增強心肌收縮力，加快心率。孤束核區(qū)域缺血14 d 至缺血28 d NPR-A 表達的增加，可能與缺血后期激活此處的神經(jīng)元來抑制升壓區(qū)的交感興奮相關(guān)。NPR-A 蛋白在心肌缺血后孤束核與延髓腹側(cè)部表達的差異，可能與這些區(qū)域在心血管調(diào)控中的作用不同相適應(yīng)。

圖3 TH 陽性神經(jīng)元與NPR-A 陽性神經(jīng)元在腦干內(nèi)的分布Fig 3 Double immunofluorescence for TH and NPR-A positive neurons in brainstem (×100)

圖4 TH 陽性神經(jīng)元與NPR-C 陽性神經(jīng)元在腦干內(nèi)的分布Fig 4 Double immunofluorescence for TH and NPR-C positive neurons in brainstem (×100)

孤束核是壓力反射的第一級中樞，接受動脈壓力感受器投射，并對這些信息進行整合后投射到延髓吻段腹外側(cè)區(qū)和延髓尾段腹外側(cè)區(qū)，維持血壓的相對穩(wěn)定。兒茶酚胺可以直接調(diào)控到孤束核的內(nèi)臟初級傳入［12］;而膽堿能神經(jīng)元則直接參與了壓力感受器反射過程［5］。本實驗的結(jié)果顯示，在孤束核內(nèi)僅有少量、散在的NPR-A/TH 雙標(biāo)記神經(jīng)元，而有較多的NPR-C/TH 雙標(biāo)記神經(jīng)元;但未見NPR-A/ChAT 或NPR-C/ChAT 雙標(biāo)記神經(jīng)元。這提示，心肌缺血后分泌增加的利鈉肽在孤束核區(qū)域?qū)π难芊瓷涞恼{(diào)節(jié)，可能不是直接通過影響膽堿能和兒茶酚胺能神經(jīng)元的活動實現(xiàn)的，其具體的生理機制尚需進一步研究。

［1］Chopra S，Cherian D，Verghese PP，et al．Physiology and clinical significance of natriuretic hormones［J］．Indian J Endocrinol Metab，2013，17:83-90．

［2］Marei HE．Fine structural and immunohistochemical localization of cardiac hormones (ANP)in the right atrium and hypothalamus of the white rat［J］．Eur J Morphol，2002，40:37-41．

［3］Tsukada T，Nobata S，Hyodo S，et al．Area postrema，a brain circumventricular organ，is the site of antidipsogenic action of circulating atrial natriuretic peptide in eels［J］．J Exp Biol，2007，210:3970-3978．

［4］Abdelalim EM，Osman AH，Takada T，et al．Immunohistochemical mapping of natriuretic peptide receptor-A in the brainstem of Macaca fascicularis［J］．Neurosci，2007，145:1087-1096．

［5］Vieira AA，De Luca LA Jr，Colombari E，et al．Commissural NTS lesions enhance the pressor response to central cholinergic and adrenergic activation［J］．Neurosci Lett，2012，521:31-36．

［6］吳雪梅，王琛，謝紅，等．NF-кB 參與七氟烷預(yù)處理所致延遲性抗大鼠心肌缺血再灌注損傷［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33:39-43．

［7］Izumi T，Saito Y，Kishimoto I，et al．Blockade of the natriuretic peptide receptor guanylyl cyclase-A inhibits NF-kappaB activation and alleviates myocardial ischemia/reperfusion injury［J］．J Clin Invest，2001，108:203-213．

［8］劉紅櫻，王蔚，葛均波．B 型利鈉肽與急性冠狀動脈綜合征的研究進展［J］．上海醫(yī)學(xué)，2011，34:237-239．

［9］Sawada Y，Inoue M，Kanda T，et al．Co-elevation of brain natriuretic peptide and proprotein-processing endoprotease furin after myocardial infarction in rats［J］．FEBS Lett，1997，400:177-182．

［10］Hystad ME，Oie E，Grogaard HK，et al．Gene expression of natriuretic peptides and their receptors type-A and-C after myocardial infarction in rats［J］．Scand J Clin Lab Invest，2001，61:139-150．

［11］牛麗靜，白云，苗智慧，等．心肌缺血對大鼠延髓利鈉肽受體表達的影響［J］．中國病理生理雜志，2014，30:220-225．

［12］郭峰，馬文領(lǐng)，張文斌，等．孤束核內(nèi)兒茶酚胺能神經(jīng)元匯聚內(nèi)臟傳入與口面部軀體傷害性信息并向臂旁核投射［J］．神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2006，22:173-177．