林秀芹，鄭 京，劉加林，劉慈赟，吳心虹，張 娟，陳小英

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350001;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院腎內(nèi)科，福建福州350004;3.貴州省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州貴陽550000)

糖皮質(zhì)激素以其抗感染、抑制免疫等作用在腎病綜合征等疾病治療中應(yīng)用廣泛。然而糖皮質(zhì)激素長期大劑量使用會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生［1］，其發(fā)病的根本機(jī)制是:成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB)數(shù)量減少或活性降低，以及破骨細(xì)胞(Osteoclast，OC)數(shù)量增加或活性增強(qiáng)，其中OB 生成不足占有主要地位［2］。因此假設(shè)有一種治療方法如果能夠促進(jìn)OB生成，就會(huì)對(duì)骨質(zhì)疏松具有改善作用或可延緩其形成過程。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)屬于干細(xì)胞家族的重要成員，具有多向分化潛能、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)［3］，并且在連續(xù)傳代培養(yǎng)或者冷凍保存后仍然具有多向分化潛能，因此它可以作為“種子細(xì)胞”在組織器官損傷的修復(fù)中得到應(yīng)用［4］。BMSCs 能在體內(nèi)骨損傷部位定向分化為新的成骨細(xì)胞，加速骨損的修復(fù)［5］。橈骨節(jié)段性缺損大鼠模型中植入BMSCs及同種異體骨顆粒復(fù)合物組骨缺損修復(fù)速度明顯優(yōu)于單獨(dú)植入等量單純同種異體骨顆粒組［6］。因此，假設(shè)對(duì)阿霉素腎病大鼠進(jìn)行尾靜脈注射BMSCs［7］，BMSCs 可能會(huì)起到延緩潑尼松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松的形成，為了驗(yàn)證這一想法，選取了與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)的骨代謝指標(biāo)骨保護(hù)蛋白(osteoprotegerin，OPG)和核因子κB 受體活化因子配體(κB receptor activator of nuclear factor ligand，RANKL)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量180 ～220 g，雌雄各25只，共50 只(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):70092411)，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施為福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心鼠類實(shí)驗(yàn)室，清潔級(jí)。動(dòng)物使用符合福建省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)管理?xiàng)l例。

1.2 大鼠BMSCs 的提取、培養(yǎng)與鑒定

1)提取與培養(yǎng):健康幼齡SD 大鼠(60 ～80 g)，無菌條件下分離股骨和脛骨后置超凈臺(tái)內(nèi)，暴露骨髓腔。用含10%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，過200 目篩后置37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 后棄懸浮細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基。每3 天換液1 次。原代細(xì)胞達(dá)80%匯合后傳代。

2)鑒定:第3 代BMSCs 形態(tài)上趨于一致，呈梭形的成纖維細(xì)胞樣，呈漩渦狀或輻射狀排列(圖1)。細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD90 和CD29 表達(dá)陽性，陽性率為99.1% 和98.3%;陰性標(biāo)志物CD34、CD45 呈低表達(dá)，符合BMSCs 表面標(biāo)志表達(dá)(圖2)。取3 ～4 代符合BMSCs 表面標(biāo)志表達(dá)的細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射106/mL 的BMSCs 0.5 mL 用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種前，均進(jìn)行錐蟲藍(lán)細(xì)胞活力計(jì)數(shù)，細(xì)胞活力均在98%以上。

圖1 第3 代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)Fig 1 The third generation of BMSCs(×200)

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig 2 The test results by FCM of BMSCs

1.3 試劑

SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、RNAiso Plus、ExScriptTMRT Reagent Kit 試劑盒和Rat_Gapdh_primer(TaKaRa 公司)、鹽酸阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物的造模、分組及給藥方法:以隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為:A 組(正常組)、B 組(模型組)、C 組(激素治療組)、D 組(干細(xì)胞治療組)、E 組(干細(xì)胞+激素治療組)，每組10 只，除A 組外，各組大鼠經(jīng)尾靜脈1 次性注射鹽酸阿霉素6.5 mg/kg［8］，A組經(jīng)尾靜脈1 次性注射等量0.9%氯化鈉注射液。造模7 d 后，對(duì)大鼠進(jìn)行24 h 尿蛋白定性，在+ +以上，提示造模成功［9］。造模成功后，A、B 組以每日0.9%氯化鈉注射液灌胃;C 組以潑尼松10 mg/(kg·d)灌胃;D 組以干細(xì)胞20 mL/(kg·d)灌胃;E 組以干細(xì)胞20 mL/(kg·d)灌胃，同時(shí)每日以潑尼松10 mg/(kg·d)灌胃。于第21 天與第35 天各組分批處死采血，取材。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，大鼠造模1 周后開始出現(xiàn)尿蛋白，第3 周、第5 周B 組尿蛋白明顯升高(P＜0.05)。

1.4.2 24 h 尿蛋白的定量:以代謝籠收集24 h 尿液，以雙縮脲比色法測尿蛋白。

1.4.3 骨代謝生化指標(biāo)的測定:各組經(jīng)腹主動(dòng)脈采血3 mL，離心保留血清，以ELISA 法測定各組骨保護(hù)蛋白(OPG)、核因子κB 受體活化因子配體(RANKL)水平。

1.4.4 Real time PCR 檢測OPG 和RANKL mRNA:取出一側(cè)脛骨，去除軟組織和骨髓，－80 ℃保存。采用Trizole 一步法提取組織總RNA。在紫外分光光度儀上測算出RNA 濃度，采用ExScriptTMRT Reagent Kit 試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒以7500 Software v2.0.5 進(jìn)行熒光擴(kuò)增。采用SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法，引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genebank 序列，由寶生物工程(大連)有限公司合成，檢測基因的上、下游引物序列(表1)。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)，GAPDH 作為內(nèi)參照。再根據(jù)CT 值計(jì)算出各組mRNA 的含量，進(jìn)行各組的比較。

表1 檢測基因的引物序列和產(chǎn)物長度Table 1 Detection of gene sequences of primers and the length of the product

1.4.5 Western blot 檢測OPG 和RANKL 蛋白:夾取脛骨組織200 mg，在液氮中研成粉末，加入400 μL細(xì)胞裂解液迅速混勻，抽取到1.5 mL 離心管內(nèi)，在冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min 離心1 h，取出上清液置離心管內(nèi)備用。BAC 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。使蛋白變性以便于保存。80 V 124 min 進(jìn)行電泳分離，切膠，在電壓100 V 下合適時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入1∶1 000 一抗，4 ℃搖床過夜。TBST 洗膜3次，每次5 ～10 min。然后加入1∶1 000 辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫1 h，TBST 洗膜3 次。顯影、定影后凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片掃描，計(jì)算吸光度值，應(yīng)用目的蛋白/內(nèi)參照吸光度的比值，反映蛋白的相對(duì)含量，進(jìn)行組間比較分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS15.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD 法。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠24 h 尿蛋白定量水平比較

第7 天，與A 組比較，B 組及各治療組大鼠24 h尿蛋白量開始增加(P＜0.05)。第21 天，與B 組比較，C 組、E 組降低(P＜0.05)。第35 天，與B 組比較，D 組降低(P＜0.05)，C 組、E 組也降低(P＜0.01)，C 組、D 組、E 組之間無明顯差異。第35 天與第21 天相比較，B 組升高，C 組、E 組降低(P＜0.05)(表2)。

表2 各組24 h 尿蛋白定量水平Table 2 24 hours urinary protein level in different groups (±s，mg/24 h，n=10)

表2 各組24 h 尿蛋白定量水平Table 2 24 hours urinary protein level in different groups (±s，mg/24 h，n=10)

#P＜0.05 compared with 21 days in the same group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with group A in the same period;△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with group B in the same period．

group7 days21 days35 days A3.19 ±1.885.59 ±1.674.58 ±2.22 B10.94 ±6.91*40.98 ±15.37＊＊ 61.04 ±10.55#＊＊C18.27 ±16.65*19.96 ±5.32＊△12.49 ±7.35#＊△△D17.65 ±7.61*43.80 ±22.46＊＊ 38.40 ±36.80＊＊△E8.42 ±3.13*15.33 ±11.32＊△ 11.15 ±0.30＊△△

2.2 各組血清OPG、RANKL 的表達(dá)比較

1)與本組21 天比較，C 組RANKL 升高(P＜0.05)。2)與B 組比較，第21 天C 組RANKL 升高(P＜0.01)，OPG 降低(P＜0.05);第35 天，C 組RANKL 升高(P＜0.01)，OPG 降低(P＜0.05)。3)與D 組比較，B 組、C 組、E 組OPG 均降低，C 組、E組RANKL 均升高(P＜0.05，P＜0.01)。4)與C 組比較，E 組OPG 升高(P＜0.05)，RANKL 降低(P＜0.05)(表3)。

表3 各組血清蛋白OPG 和RANKL 的表達(dá)Table 3 The serum level of OPG and RANKL in different groups(±s，n=10)

表3 各組血清蛋白OPG 和RANKL 的表達(dá)Table 3 The serum level of OPG and RANKL in different groups(±s，n=10)

＊P＜0.05 compared with 21 days in the same group;△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with group B in the same period;#P＜0.05 compared with group C in the same period;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 compared with group D in the same period．

grouptime(days)OPG(ng/mL)RANKL(pg/mL)A211.21 ±0.4319.22 ±1.02 351.33 ±0.5918.74 ±3.03 B211.28 ±0.45▲21.27 ±2.63 351.24 ±0.49▲21.58 ±2.18 C210.71 ±0.17△▲▲52.65 ±3.58△△▲▲350.65 ±0.22△▲▲66.90 ±5.55＊△△▲▲D212.92 ±0.4319.97 ±2.84 352.94 ±0.6920.06 ±2.34 E211.68 ±0.28#▲▲38.34 ±1.48#▲▲351.86 ±0.49#▲▲40.24 ±2.52#▲▲

2.3 各組骨組織OPG、RANKL mRNA 的表達(dá)比較

1)與A 組比較，第21 天，B 組OPG、RANKL mRNA升高(P＜0.05，P＜0.01)，第35 天，OPG、RANKL mRNA 降低(P＜0.01)。2)與D 組比較，C 組OPG mRNA 降低(P＜0.01)，RANKL mRNA升高(P＜0.05);E 組OPG mRNA 降低(P＜0.05)(表4)。

2.4 Western blot 檢測

各組蛋白OPG、RANKL 的表達(dá)比較(圖3，4，5)1)與本組21 天比較，C 組OPG 降低(P＜0.05)，RANKL 升高(P＜0.05)，E 組RANKL 降低(P＜0.05)。2)與B 組比較，C 組OPG 降低(P＜0.01)，RANKL 升高(P＜0.01)。3)與D 組比較，C 組、E組OPG 均降低(P＜0.01)，RANKL 均升高(P＜0.01)。4)與C 組比較，D 組、E 組OPG 均升高(P＜0.01)，RANKL 均降低(P＜0.01)。

表4 各組骨組織OPG、RANKL mRNA 的表達(dá)Table 4 The expression of bone tissue OPG and RANKL mRNA in different groups(±s，n=10)

表4 各組骨組織OPG、RANKL mRNA 的表達(dá)Table 4 The expression of bone tissue OPG and RANKL mRNA in different groups(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with group A in the same period;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with group D in the same period．

grouptime(days)OPG mRNARANKL mRNA A211.011.01 351.011.01 B211.02 ±0.26*1.03 ±0.03＊＊350.97 ±0.26＊＊0.95 ±0.13＊＊C210.60 ±0.07##1.29 ±0.22#350.35 ±0.23##1.35 ±0.15#D211.12 ±0.160.73 ±0.11 351.10 ±0.050.75 ±0.21 E210.78 ±0.16#1.15 ±0.24 350.82 ±0.17#1.14 ±0.17

圖3 實(shí)驗(yàn)3 周和5 周時(shí)蛋白OPG 和RANKL 的表達(dá)Fig 3 The OPG and RANKL protein expression(3 weeks，5 weeks)

3 討論

成骨細(xì)胞(OB)和破骨細(xì)胞(OC)共同調(diào)控骨轉(zhuǎn)化，生理狀態(tài)下兩種細(xì)胞通過OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)維持著骨骼的動(dòng)態(tài)平衡［10］。OPG 和RANKL均由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，RANKL 與破骨細(xì)胞表面受體(RANK)發(fā)生相互作用從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化［11］。而OPG 直接與RANKL 結(jié)合，競爭性抑制RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化［10］，OPG 的過表達(dá)促進(jìn)了前成骨細(xì)胞向成熟的成骨細(xì)胞的分化［12］。

圖4 實(shí)驗(yàn)3 周和5 周時(shí)蛋白OPG 的表達(dá)水平Fig 4 The expression level of OPG protein(3 weeks，5 weeks)

圖5 實(shí)驗(yàn)3、5 周時(shí)蛋白R(shí)ANKL 的相對(duì)表達(dá)水平Fig 5 The expression level of RANKL protein(3 weeks，5 weeks)

阿霉素腎病是一經(jīng)典的腎病模型，其病理表現(xiàn)類似于人類微小病變型腎病。本實(shí)驗(yàn)中第7 天，其余各組大鼠尿蛋白均較A 組升高;可看出腎病大鼠造模成功。第21 天和35 天，C、D、E 組尿蛋白均較B 組降低，表明干預(yù)治療組均有明顯降尿蛋白作用，從表3 中可以看出C 組降蛋白尿效果雖最明顯，但與B 組比較，其血清RANKL 增多、OPG 減少，且骨組織OPG、OPGmRNA 也減少，RANKL、RANKL mRNA 也增多，OPG/RANKL 的比值下降最明顯，表明可能出現(xiàn)OB 分化受抑制，OC 分化活躍，骨質(zhì)丟失增加，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的形成。而D 組和E 組降蛋白尿效果雖較C 組弱，但與C 組比較，其血清OPG 表達(dá)升高，RANKL 減少，骨組織OPG、OPG mRNA增多，RANKL、RANKL mRNA 的表達(dá)減少，OPG/RANKL 的比值增高，那么OB 分化增多，OC分化受抑制，對(duì)維持骨代謝平衡有利。E 組OPG mRNA及蛋白較B 組升高，RANKL mRNA 及蛋白較B 組降低，表明干細(xì)胞+激素治療能一定程度上逆轉(zhuǎn)潑尼松對(duì)OB 分化的抑制作用和對(duì)OC 分化的促進(jìn)作用，從而延緩潑尼松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松的形成。綜上數(shù)據(jù)可看出E 組在降尿蛋白及改善骨代謝中表現(xiàn)最優(yōu)，并且隨著時(shí)間延長效果更明顯。

總之，BMSCs 在改善骨代謝方面優(yōu)于潑尼松和BMSCs 聯(lián)合潑尼松治療，但在降低尿蛋白方面比不上后兩者，并且用時(shí)較長，而潑尼松單獨(dú)應(yīng)用可出現(xiàn)骨代謝異常，最終通過OPG/RANKL/RANK 通路誘發(fā)骨質(zhì)疏松，BMSCs 聯(lián)合潑尼松治療不僅能明顯降低蛋白尿，并且能改善骨代謝指標(biāo)，通過上述通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞生成，從而發(fā)揮促進(jìn)骨重建和減少骨吸收的作用，延緩潑尼松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松的形成。因此，BMSCs 聯(lián)合潑尼松治療在改善腎病患者預(yù)后和預(yù)防骨質(zhì)疏松中可做首選，當(dāng)然應(yīng)視具體情況而定。

［1］Briot K，Roux C．Corticosteroid-induced osteoporosis［J］．Rev Med Interne，2013，3:315-323．

［2］Zofkova I．Drug induced osteoporosis［J］．Vnitr Lek，2013，59:59-63．

［3］Pourrajab F，F(xiàn)orouzannia SK，Tabatabaee SA．Molecular characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells，source of regenerative medicine［J］．Int J Cardiol，2013，16:125-131．

［4］Pittenger M．Sleuthing the source of regeneration by MSCs［J］．Cell Stem Cell，2009，5:8-10．

［5］Zaidi M，Sun L，Blair HC．Special stem cells for bone［J］．Cell Stem Cell，2012，10:233-234．

［6］鄧華民，陳杰，劉志權(quán)，等．骨保護(hù)素/骨保護(hù)素配體(OPG/OPGL)在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合同種骨修復(fù)骨缺損中的表達(dá)及意義［J］．中國骨腫瘤骨病，2010，9:346-350．

［7］萬建新，郭琦，潘陽彬，等．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)損傷腎小管上皮細(xì)胞:可能與可行?［J］．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，32:5903-5907．

［8］支勇，曹式麗．阿霉素腎病動(dòng)物模型的國外研究進(jìn)展［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2008，10:933-935．

［9］吳文先，陳團(tuán)營，劉霞等．腎綜顆?？拱⒚顾啬I病大鼠脂質(zhì)過氧化損傷的實(shí)驗(yàn)研究［J］．廣西中醫(yī)藥，2008，31:59-61．

［10］Lacey DL，Boyle WJ，Simonet WS，et al．Bench to bedside:elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab［J］．Nat Rev Drug Discov，2012，11:401-419．

［11］Samara S，Dailiana Z，Chassanidis C，et al．Expression profile of osteoprotegerin，RANK and RANKL genes in the femoral head of patients with avascular necrosis［J］．J Exp Mol Pathol，2013，96:9-14．

［12］Yu H，de Vos P，Ren Y．Overexpression of osteoprotegerin promotes preosteoblast differentiation to mature osteoblasts［J］．Angle Orthod，2011，81:100-106．