周 楊，周云川，巫靜嫻，喻姍姍，趙 涌

(重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學教研室分子醫(yī)學與腫瘤研究中心，重慶400016)

Sulfiredoxin-1(Srxn1)是內源性的小分子抗氧化蛋白，Srxn1 在組織細胞中具有抗氧化、抗凋亡和抗炎性反應等保護作用，但具體的機制仍不清楚。在低水平H2O2刺激下，缺少Srxn1 功能的細胞，會導致其氧化還原平衡失調及凋亡［1］。吸煙人群易患COPD，同時患者肺組織內Srxn1 的表達極低，可能與吸煙打破患者肺內氧化/抗氧化平衡系統(tǒng)有關［2］。Peroxiredoxins(Prdxs)屬于新的抗氧化蛋白超家族，它包含PrdxⅠ～PrdxⅣ，其中PrdxI ～Ⅳ是最主要抗氧化亞型。其在機體的抗氧化防御系統(tǒng)中有著至關重要的作用［3］。Srxn1 作為抗氧化因子能通過催化過氧化的Prdxs，使其重新恢復抗氧化功能。本研究旨在探討星形膠質細胞氧化應激損傷過程中Srxn1 對Prdxs 活性的調控作用，為腦組織缺血后過氧化應激損傷保護提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

新生SD 大鼠［重慶醫(yī)科大學、SPF 級、動物合格證號SCXY(渝)20020003］、Srxn1 干擾慢病毒載體與陰性載體(上海吉瑪制藥技術有限公司)、DMEM/F12 和FBS(Gibco 公司)、H2O2(Sigma 公司)、LDH 和SOD(南京建成公司)、RNAiso Plus、RT-PCR 試劑盒、SYBR? Premix Ex Taq? (TaKaRa公司)、兔抗-GFAP 多克隆抗體(Santa Cruz 公司)、兔抗-Srxn1 多克隆抗體(北京博奧森公司)、兔抗-PrdxI-Ⅳ和兔抗Prdx-SO2/3H(Abcam 公司)。

1.2 星形膠質細胞的原代培養(yǎng)及純度鑒定

提取大腦皮質細胞，進行星形膠質細胞原代培養(yǎng)。GFAP 免疫組化染色鑒定星形膠質細胞純化率。0.01 mol/L PBS 快速漂洗待鑒定細胞，并用4%多聚甲醛固定30 min。用0.01 mol/L PBS 再次漂洗，5 min × 3 次。滴加適量封閉血清，濕盒，37 ℃，30 min，勿洗，滴加一抗GFAP(1∶50)，4 ℃濕盒過夜。0.01 mol/L PBS 漂洗，5 min ×3 次，滴加熒光二抗Alexa Fluor 594 (1∶100)，濕盒，37 ℃，30 min，PBS 清洗，避光加入Hoechst 33342 工作液標記所有細胞核，室溫作用20 min，PBS 清洗，甘油封片，熒光顯微鏡下發(fā)光。Hoechst 33342 染色顯示細胞核并代表細胞總數(shù)，隨機選取4 個高倍視野，觀察GFAP 陽性率，并可以同時觀察細胞的慢病毒轉染效率。

1.3 星形膠質細胞的轉染

根據(jù)前期實驗結果，由上海吉瑪制藥技術有限公司設計、構建shRNA-Srxn1-LV3 干擾的慢病毒載體片段，Sh-RNA 序列為5'-CATCCACACCAGACTTG CAGT-3'，陰性對照序列為5'-TTCTCCGAACGTGTC ACGT-3'。將Sh-RNAs 按照說明書轉染至星形膠質細胞中，并在熒光顯微鏡下觀察其轉染效率。

1.4 H2O2 星形膠質細胞模型的建立

1)用DMEM/F12 完全培養(yǎng)液將H2O2母液稀釋至濃度為10－3mol/L。2)加入稀釋后H2O2至需處理的星形膠質細胞中，并加入適量的DMEM/F12 完全培養(yǎng)液使其濃度為100 μmol/L。移至37 ℃、5%CO2孵箱內繼續(xù)培養(yǎng)。3)6 h 后即可進行后續(xù)試驗。

1.5 LDH 漏出率的檢測

根據(jù)其試劑盒說明書進行操作。酶標儀檢測(A450nm)待測組吸光度值。

1.6 SOD 的檢測

根據(jù)其試劑盒說明書進行操作。酶標儀檢測(A450nm)待測組吸光度值從而計算出SOD 含量。

1.7 Western blot 檢測Srxn1 蛋白表達水平

提取細胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度。根據(jù)所測蛋白濃度配平后進行上樣、SDS 凝膠電泳、切膠、轉膜、TBST 洗膜和封閉，加入稀釋好的目的蛋白一抗4 ℃孵育過夜，復溫20 min 后，TBST 洗膜，加入稀釋好的目的蛋白的二抗，室溫孵育1.5 h，TBST 洗膜，ECL 化學發(fā)光檢測。運用Quantity One軟件分析，檢測目的蛋白條帶吸光度值與內參β-actin 條帶吸光度值。目的蛋白的相對表達量=目的蛋白條帶吸光度值/內參β-actin 條帶吸光度值。

1.8 Real-time QPCR 檢測Srxn1 mRNA 表達水平

根據(jù)試劑盒說明書，提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA 作為模板，進行QPCR 反應。引物序列:Srxn1 上游5'-CCCAAGGCGGTGACTACTAC-3'，下游5'-GGCAGGAATGGTCTCTCTCTGTG-3';β-actin 上游5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'，下游5'-CCCAT ACCCACCATCACACC-3'。反應體系:2 μL cDNA 模板，各1 μL 10 mol/L 的上下游引物，12.5 μL 2 ×SYBR? Premix Ex Taq?，8.5 μL ddH2O2。反應條件:95 ℃10 s;95 ℃5 s，60 ℃15 s，72 ℃15 s，39個循環(huán);72 ℃5 s，95 ℃持續(xù)。運用2ΔΔCt［10］方法Bio-Rad CFX Manager Software 軟件進行分析。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大鼠星形膠質細胞純度鑒定及轉染效率鑒定

傳2 代星形膠質細胞胞體大，胞核大而圓常偏于胞體一側。細胞突觸分支多，且豐富，相互交織成網(wǎng)狀。星形膠質細胞紅色熒光陽性率達到90%以上(圖1A，B)。同時觀察到，細胞慢病毒載體的綠色熒光轉染效率達到85%以上(圖1C，D)。

2.2 Sh-RNA 干擾效率及干擾Srxn1 對氧化應激損傷的星形膠質細胞Srxn1 表達的影響

與對照組及陰性對照組相比，干擾Srxn1 后Srxn1 蛋白表達下調約59.2%(P＜0.01);H2O2處理后Srxn1 蛋白上調137.3% (P＜0.01)。與Sh-Srxn1組相比，Sh-Srxn1 + H2O2組的Srxn1 蛋白表達增高135.6%(P＜0.01)(圖2)。與對照組相比較，干擾Srxn1 后Srxn1 基因水平降低至36.4%(P＜0.01)(圖2)。

2.3 干擾Srxn1 對氧化應激損傷的星形膠質細胞損傷程度的影響

與對照組及陰性對照組相比，H2O2處理星形膠質細胞后，LDH 漏出率增加170.9%(P＜0.01)。當干擾Srxn1 后，細胞的損傷程度進一步增高98.2%(P＜0.01)(圖3)。

2.4 干擾Srxn1 對氧化應激損傷的星形膠質細胞SOD 活性的影響

與對照組及陰性對照組相比，Sh-Srxn1 組SOD 活性降低32.8% (P＜0.01);H2O2組SOD 活性降低56.4%(P＜0.01);當給予H2O2處理后再干擾Srxn1，SOD 活性進一步降低76.9%(P＜0.05)(圖4)。

圖1 原代星形膠質細胞純度及轉染效率Fig 1 Identification of astrocytes purity and transfection efficiency(×200)

圖2 Sh-RNA 干擾效率及干擾Srxn1 對氧化應激損傷的星形膠質細胞Srxn1 表達的影響Fig 2 The efficiency of Sh-RNA interference and the expression of Srxn1 in response to oxidative stress(n=3)

圖3 干擾Srxn1 對氧化應激損傷的星形膠質細胞損傷程度的影響Fig 3 Sh-Srxn1 mediated Srxn1 increased cell damage(n=6)

2.5 干擾Srxn1 對氧化應激損傷的星形膠質細胞2-Cys Prdxs 和Prdx-SO2/3H 表達的影響

與對照組及陰性對照組相比，H2O2損傷后PrdxⅠ～Ⅳ和Prdx-SO2/3H 的蛋白水平上調(P＜0.01)。干擾Srxn1 則可抑制PrdxⅠ～Ⅳ蛋白水平的增高，提高Prdx-SO2/3H 蛋白水平的表達(圖5)。

3 討論

腦血管病是當今3 大致死疾病之一，是首位致殘因素［4］。氧化應激很可能是造成缺血性腦血管病不可逆損傷的關鍵因素。前期研究表明Srxn1 可以保護PC12 細胞免H2O2誘導的氧化應激性損傷［5］。目前Srxn1 在星形膠質細胞中的抗氧化保護作用及可能機制尚不清楚。

圖4 干擾Srxn1 對氧化應激損傷的星形膠質細胞SOD 活性的影響Fig 4 Effects of Srxn1 on superoxide dismutase(SOD)activity(n=6)

為了進一步探討Srxn1 在腦血管疾病中的神經保護功能。本研究采用大鼠星形膠質細胞作為靶細胞，構建H2O2模型，應用慢病毒干擾技術，研究Srxn1 的神經保護。Srxn1 作為一個內源性的小分子抗氧化蛋白，在細胞受到外界損傷刺激會誘導其表達水平增高［6］。H2O2損傷后，Srxn1 蛋白水平升高。LDH 是衡量細胞損傷的重要指標，結果顯示H2O2損傷后，細胞LDH 漏出率顯著增加，且干擾Srxn1 后LDH 漏出率增加更顯著。SOD 是反映氧化應激損傷的有效指標。H2O2損傷后，細胞內SOD活力明顯下降，且干擾Srxn1 后使SOD 活力下降更為明顯。這些結果表明干擾Srxn1 會加重細胞的氧化應激性損傷。

圖5 干擾Srxn1 對氧化應激損傷的星形膠質細胞2-Cys Prdxs 和Prdx-SO2/3H 表達的影響Fig 5 Srxn1 depletion resulted in decreased expression of Prdxs and retarded the reduction of Prdx-SO2/3H(n=3)

Peroxiredoxins(Prdxs)屬于新的不斷擴展的抗氧化蛋白超家族，它包含PrdxⅠ～PrdxVI［3］。當腦缺血再灌注損傷發(fā)生時，Prdxs 過度氧化。在MCA供血區(qū)域，包在中樞神經系統(tǒng)中，Prdxs 作為自由基清除劑，對很多細胞起著重的保護作用，括皮質和紋狀體［7］。在神經細胞體外缺血的研究中，2-Cys Prdxs 在高表達的模型和神經退行性病變組織中都起著重要的作用［8-10］。Srxn1 可以特異性地將過氧化的Prx-SO2/3H 還原為帶有巰基的形式，恢復Prdxs 的抗氧化活性，可以進一步維持細胞內環(huán)境氧化/抗氧化平衡。在膠質細胞氧化應激損傷過程中是否存在著Srxn1 對其下游Prdxs 因子的調控作用未見有文獻報道。結果顯示，干擾Srxn1 后，2-Cys Prdxs 表達降低，而Prdx-SO2/3H 作為過氧化的標志物在星形膠質細胞中明顯的增高。這些結果表明，在分子水平上Srxn1 可通過抑制Prdx-SO2/3H 的形成，增加2-Cys Prdxs 的活性而發(fā)揮抗氧化損傷的作用。

綜上所述，Srxn1 作為一個重要的氧化應激誘導的基因，在干擾Srxn1 后導致星形膠質細胞對H2O2誘導的氧化應激性損傷的敏感性增加。Srxn1在星形膠質細胞氧化應激損傷中的確起著重要的保護作用。且Srxn1 可通過抑制Prdx-SO2/3H 的形成，提高抗氧化蛋白2-Cys Prdxs 的活性，從而發(fā)揮抗氧化應激損傷的作用。

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