崔虎哲，王申桐，金鐵峰，周憲春，元奎昌，張松男

(延邊大學1.附屬醫(yī)院影像科;2.腫瘤研究所;3.附屬醫(yī)院科教處;4.附屬醫(yī)院心內(nèi)科;5.附屬醫(yī)院腫瘤科，吉林延吉133000)

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(pithelial-mesenchymal transition，EMT)是惡性腫瘤發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，在肺癌的研究證實，EMT 與肺癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1-2］。曲古抑菌素A(triehostatin A，TSA)是組蛋白去乙酰化酶(histonedeaeetylase，HDAC)抑制劑，可促進組蛋白的乙?；?、激活抑癌基因表達、抑制細胞增殖、引起細胞分化或凋亡［3］。有研究表明TSA 可以抑制肺癌細胞的增殖及遷移［4］，但其具體機制仍不清楚，尤其是TSA 調(diào)控EMT 在肺癌的研究未見報道。本研究旨在通過探明TSA 抑制A549 細胞的作用機制，為臨床治療肺癌提供新的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人肺腺癌A549 細胞系和正常支氣管上皮16HBE 細胞系(ATCC);胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶和二甲基亞楓(DMSO)等化學試劑(北京華美公司);Western blot 實驗相關(guān)試劑及MTT 試劑(武漢博士德生物有限公司);EMT 相關(guān)標志蛋白抗體(抗E-cadherin、抗Vimentin、抗Snail、抗GSK-3β 單克隆抗體)(Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT 比色法檢測細胞增殖能力:將A549 及16HBE 細胞系接種于含10%胎牛血清、5%青霉素/鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化并傳代。取對數(shù)增殖期的A549 及16HBE 細胞以2 ×103個/孔接種于96孔板中，待細胞貼壁后加入終濃度為0、0.01、0.1、1、10 和100 μmol/L 的TSA，每種濃度設(shè)3 個平行復孔，對照組加入等體積的培養(yǎng)液。72 h 后加入50 μL/孔的MTT，4 h 后棄上清，加入200 μL/孔的DMSO，輕輕振蕩數(shù)分鐘，應用全波長多功能酶標儀，在570 nm 波長處測定其吸光度值，并按公式計算細胞生存率:細胞生存率(%)=實驗組吸光值/對照組吸光值×100%。

1.2.3 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移與侵襲:將5 ×105個/mL 的A549 細胞接種于6 孔板中，每孔2 mL，培育24 h。待細胞完全貼壁，用10 μL 移液槍槍頭在單層細胞上劃一條直線，用PBS 清洗3 次。分別加入含曲古抑菌素A(TSA)的培養(yǎng)液及不含TSA 的培養(yǎng)液，于0、24 和48 h 觀察并拍照。

1.2.4 Western blot 檢測:A549 細胞經(jīng)TSA 作用24 h;(濃度分別為0.1、1 和10 μmol/L)以PBS 洗2次后提取總蛋白;BrdaZford 法測定蛋白濃度;8%SDS 聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行蛋白分離;轉(zhuǎn)至PVDF 膜上;室溫下?lián)u床封閉(TBSZT +5%脫脂奶粉)2 h;加入兔抗人E-cadherin、Snail、Vimentin、GSK-3β 和β-actin 的單克隆抗體;4 ℃過夜;室溫下洗膜;加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗兔IgG 二抗;孵育2 h;ECL 曝光;觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，以進行卡方檢驗。

2 結(jié)果

2.1 TSA 明顯抑制A549 細胞增殖

1、10 和100 μmol/L 的TSA 培養(yǎng)細胞72 h 后，與未加藥對照組相比，肺癌細胞A549 明顯受到抑制(P＜0.01)。在100 μmol/L 時對16HBE 有明顯抑制作用(P＜0.05)(圖1)。

圖1 TSA 對A549 細胞的增殖具有明顯的抑制作用Fig 1 The TSA has obvious effect on A549 cells

2.2 TSA 對A549 細胞遷移能力的影響

當加入10 μmol/L 的TSA 后由于藥物的作用使細胞的遷移受抑制，而對照組未加TSA 的細胞保持了原有的遷移能力在一段時間后通過遷移將劃痕掩蓋(圖2)。

2.3 TSA 對EMT 相關(guān)標志蛋白表達的影響

48 h 時與未加藥對照組比較，在10 μmol/L 給藥組其上皮細胞表型E-cadherin 蛋白表達顯著上調(diào)(P＜0.01)，而間質(zhì)表型Vimentin、Snail 及GSK-3β的表達均下調(diào)(P＜0.01)(圖3，表1)。

3 討論

研究證實，EMT 是轉(zhuǎn)移發(fā)生的早期事件，有眾多基因及信號通路參與到EMT 的調(diào)控過程當中［5-6］。EMT 除了促進癌細胞的侵襲性增加，還誘導癌細胞表現(xiàn)出干細胞樣特點，如自我更新能力、增殖能力及抗拒凋亡的能力，并對化療藥物產(chǎn)生耐藥等［7-8］。EMT 過程中上皮標志物E-cadherin、ZO-1等表達下調(diào)，而間質(zhì)標志物N-cadherin、Snail、Vimentin 及GSK-3β 等表達上調(diào)，使腫瘤細胞脫離原發(fā)病灶，突破基底膜最終形成遠隔轉(zhuǎn)移［2］。最近，表觀遺傳學在腫瘤研究領(lǐng)域正成為新的熱點。組蛋白乙酰乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙?；?histonedeacetyltransferases，HDACs)共同調(diào)控著真核細胞組蛋白乙?；乃?，維持機體內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡。TSA 是研究得最為廣泛的組蛋白去乙?；敢种苿?。研究表明，TSA 可誘導P53 表達增高而誘導肺癌細胞的凋亡［9］，并且TSA 聯(lián)合順鉑在體內(nèi)及體外明顯抑制卵巢癌細胞的增殖及遷移［10］。有關(guān)組蛋白與EMT 的作用關(guān)系已有部分報道。研究證實，HDAC1 的過表達導致E-cadherin 啟動子的活性減弱，而以轉(zhuǎn)染shRNA 的方法下調(diào)HDAC1 的表達可有效抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，證實了HDAC1 與E-cadherin 的表達及EMT 的發(fā)生有關(guān)［11］。

圖2 TSA 對A549 細胞遷移能力的影響Fig 2 The TSA significantly inhibited migration ability of A549 cells

表1 不同濃度TSA 作用于A549 細胞48 h 后相對蛋白表達變化Table 1 Relative expression level of the protein by treated with different concentrations of TSA after 48 hours on A549 cells(±s，n=3)

表1 不同濃度TSA 作用于A549 細胞48 h 后相對蛋白表達變化Table 1 Relative expression level of the protein by treated with different concentrations of TSA after 48 hours on A549 cells(±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control groups．

groupE-cadherin/β-actinSnail/β-actinVimentin/β-actinGSK-3β/β-actin control0.181 ±0.0111.034 ±0.0130.641 ±0.0050.720 ±0.001 0.10.316 ±0.0470.485 ±0.0060.605 ±0.0240.532 ±0.008 1 0.289 ±0.0230.476 ±0.0420.687 ±0.0310.511 ±0.004 100.865 ±0.015＊＊0.147 ±0.005＊＊0.081 ±0.007＊＊0.552 ±0.012*

圖3 TSA 對EMT 相關(guān)蛋白表達的影響Fig 3 EMT significantly inhibited by treatment of TSA

本研究發(fā)現(xiàn)TSA 對肺癌細胞系A(chǔ)549 的抑制作用較明顯，而對16HBE 無明顯抑制作用，說明TSA可針對性地抑制異常增殖的腫瘤細胞。劃痕實驗表明，TSA 對A549 細胞的侵襲及遷移具有明顯的抑制作用，并且通過對EMT 相關(guān)蛋白的檢測，提示TSA 抑制A549 細胞的遷移可能是通過抑制其EMT途徑而實現(xiàn)的。

本研究結(jié)果證實，TSA 通過抑制EMT 途徑抑制肺癌細胞的遷移，因此本研究對臨床治療肺癌提供了新的理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。

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