王茂先

(韓山師范學(xué)院生物學(xué)系，廣東潮州521041)

基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制是后基因組時代一個重要的研究內(nèi)容?；騿幼邮歉鞣N轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的區(qū)域，不同的轉(zhuǎn)錄因子對基因的表達(dá)調(diào)控起著不同的作用，基因的表達(dá)是這些轉(zhuǎn)錄因子共同作用的結(jié)果［1-2］。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種具有臭雞蛋味道的有毒氣體，也是繼一氧化碳(NO)和一氧化氮(CO)之后的第3 種氣體信號分子［3-5］。硫化氫是新近發(fā)現(xiàn)的繼NO 和CO 后的第3 個內(nèi)源性氣體信使，有多生物學(xué)功能，如它參與低氧性肺動脈高壓、感染性休克、急性肺損傷等多種疾病的病理生理過程［6-10］。胱硫醚γ-裂解酶(cytathiohine γ-lyase，CSE)是人類和哺乳動物細(xì)胞利用半胱氨酸或者同型半胱氨酸生成H2S 的3 種酶之一，另外兩種酶是胱硫醚β-合成酶(cytathiohine β-synthase，CBS)和3-硫基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3MST)［11-14］。許多研究表明，H2S/CSE 可能涉及大量諸如心肌缺血、動脈硬化、高血壓等心血管疾病的病理生理過程［15］。因此，研究胱硫醚γ-裂解酶基因啟動子與基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系具有重要的意義，不但可以闡明相關(guān)疾病發(fā)生的分子機(jī)制，而且有可能找到相關(guān)疾病治療的藥物新靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

血液基因組DNA 小量抽提試劑盒(Axygen 公司)。DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒和質(zhì)粒中量提取試劑盒I(Biomiga 公司)。Trans5α感受態(tài)細(xì)胞、1 kb DNA Ladder Marker、Trans 2 kb DNA Marker、Trans 2 kb Plus II DNA Marker、Trans 8 kb DNA Marker 等DNA Marker (北京全式金生物技術(shù)有限公司)。LA Taq、dNTP mix、XhoⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶、堿性磷酸酶(BAP，含該酶的相關(guān)buffer)、T4 DNA Ligase 等試劑(TaKaRa 公司)。pGL4.12 質(zhì)粒、Dual-Luciferase? Reporter Assay System 試劑盒(Promega 公司)。Xfect? 轉(zhuǎn)染試劑盒(Clontech 公司)。DEME(高糖，不含丙酮酸鈉)、RPMI-1640、DMEM/F12 1∶1 培養(yǎng)基、1 ×DPBS(不含鈣、鎂、酚紅)、1 ×0.25%胰蛋白酶/EDTA、南美胎牛血清、L-谷氨酰胺溶液(200 mmol/L)、青霉素/鏈霉素溶液(10 000 U/L 青霉素，10 000 μg/L 鏈霉素，溶于0.9%氯化鈉注射液)等細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的試劑［賽默飛世爾科技(中國)有限公司］。HEK-293 細(xì)胞和COS-7細(xì)胞兩種哺乳動物細(xì)胞系［中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)。成年昆明小鼠/Slac(25 ～30 g)(清潔級，性別隨機(jī)，動物合格證號SCXK(滬)2003-0003 號，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠基因組DNA 提取:取小鼠眼底血，收集4.5 ×10－4L 昆明小鼠的血液，加入5 ×10－5L 質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為8%的檸檬酸鈉溶液。運(yùn)用血液基因組DNA 小量抽提試劑盒，抽提小鼠DNA 基因組。具體步驟，詳見試劑說明書，1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖1A)。在GenBank 數(shù)據(jù)庫中搜索到小鼠CSE 基因啟動子的序列，設(shè)計(jì)上下游引物，目標(biāo)片段DNA長1 716 bp(－1691 ～+25 nt)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)、PCR 擴(kuò)增、連接pGL4.12 載體測序:根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中小鼠CSE 基因啟動子序列(AC_000025.1)，用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性PCR 引物(表1)，CSE 基因啟動子引物為F 和R，下劃線序列為限制性酶切位點(diǎn)，上游為KpnⅠ，下游為XhoⅠ，引物由上海博尚生物技術(shù)公司合成。應(yīng)用LA Taq，以小鼠基因組DNA 為模板進(jìn)行CSE 5'側(cè)翼區(qū)片段PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體積為5 ×10－5L，反應(yīng)條件為:94 ℃3 min，94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃2 min 30 s，進(jìn)行30 個循環(huán)，然后72 ℃10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳鑒定，DNA 膠回收試劑盒回收純化。將克隆的小鼠CSE 基因5'側(cè)翼區(qū)片段命名為KM1716，連接到pGL4.12 載體上，構(gòu)建重組載體命名為pGL4.12-KM1716，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。高純度質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒后進(jìn)行限制性酶切分析，經(jīng)鑒定片段大小正確后，送至上海博尚生物技術(shù)公司測序，測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的公布序列比對分析。

表1 PCR 引物信息Table 1 The primer's information of PCR

1.2.3 小鼠CSE 基因啟動子生物信息學(xué):分析對克隆測序獲得的小鼠CSE 基因5'側(cè)翼區(qū)域利用啟動子在線預(yù)測與分析軟件Neural Network Promoter Prediction(http://fruitfly．org:9005/seq_tools/promoter．html)、Promoter 2.0 Prediction Server(http://www．cbs．dtu．dk/services/Promoter/)和McPromoter(http://tools．genome．duke．edu/generegulation/Mc-Promoter/)預(yù)測并分析啟動子區(qū)。最后結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道并應(yīng)用CpG island 預(yù)測軟件CpG Island Searcher(http:/ /www．uscnorris．com/cpg-islands2/cpg．a(chǎn)spx)和在線軟件TFSEARCH(http://mbs．cbrc．jp/research/db/TFSEARCH．html)分析預(yù)測CpG 島和一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.4 pGL4.12-KM1716 熒光蛋白報(bào)告載體的構(gòu)建和細(xì)胞培養(yǎng):用KpnⅠ和XhoⅠ，對pGL4.12 和KM1716 雙酶切后，分別膠回收線性pGL4.12 和KM1716 片段，并用T4 DNA Ligase 16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans 5α 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒抽提質(zhì)粒后，進(jìn)行限制性酶切鑒定。送至上海博尚生物技術(shù)公司測序，經(jīng)鑒定亞克隆的片段正確后，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中。

野生型的HEK-293 細(xì)胞和轉(zhuǎn)染有pGL4.12-KM1716 的HEK-293 細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、10 ×105U/L penicillin G、100 g/L streptomycin、6.5 mmol/L L-glutamine 的高糖DMEM 培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)。野生型的COS-7 細(xì)胞和轉(zhuǎn)染有pGL4.12-KM1716 的COS-7 細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% 胎牛血清、10 ×105U/L penicillin G、100 g/L streptomycin、4.05 mmol/L L-glutamine 的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)。

1.2.5 pGL4.12-Km1716 在HEK193 細(xì)胞和COS-7細(xì)胞中的表達(dá):轉(zhuǎn)染前1 d，將生長狀態(tài)良好的HEK-293 細(xì)胞和COS-7 細(xì)胞，用胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2 ×105/孔，接種至3.5 cm 培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。次日等細(xì)胞匯合率達(dá)90%時進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，具體步驟，詳見試劑說明書。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在24 h 后，HEK-293 細(xì)胞和COS-7 細(xì)胞后，測定螢火蟲螢光素酶和海腎熒光素酶的活性。熒光強(qiáng)度采用Dual-Luciferase? Reporter Assay 試劑在SpectraMax? microplate reader 儀器進(jìn)行測定螢火蟲和海腎熒光素酶的活性，用倍數(shù)關(guān)系表示CSE 基因啟動子的相對活性。

2 結(jié)果

2.1 小鼠CSE 基因5'側(cè)翼區(qū)的擴(kuò)增

昆明小鼠/Slac 血液基因組DNA，在1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測中，出現(xiàn)單一條帶(圖1A)。PCR產(chǎn)物出現(xiàn)單一的目的條帶，片段大小與預(yù)期相符，為1 716 bp(圖1B)。酶切后的pGL4.12-KM1716 重組質(zhì)粒，在電泳圖譜中，出現(xiàn)兩條單一條帶(1.7 kb 和4.4 kb)，分別為CSE 基因啟動子片段和pGL4.12空載(圖1C)。測序后，經(jīng)過比對，確定為小鼠CSE基因5'側(cè)翼區(qū)序列，并且與GenBank 數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的序列同源性為99%。

圖1 小鼠CSE 基因啟動子的克隆及重組質(zhì)粒的鑒定Fig 1 Identification of recombinant plasmid and cloning of CSE gene promoter

2.2 小鼠CSE 基因啟動子的生物信息學(xué)分析

運(yùn)用CpG 在線預(yù)測工具(http:/ /www．uscnorris．com/cpg-islands2/cpg．Aspx)分析，發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增小鼠CSE 基因啟動子沒有符合條件的CpG 島，得到該序列中堿基C 和G 的含量之和為48.95%。在線預(yù)測工具TFSEARCH(http://mbs．cbrc．jp/research/db/TFSEARCH．html)分析得知，CSE 基因啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)檢測分值在92 分以上的有25個。其中，GATA 結(jié)合因子(GATA-binding factor，GATA)有4 個，SRY 有3 個，上游刺激因子(upstream stimulatory factor，USF)有2 個，髓鋅指蛋白1(myeloid zinc finger protein 1，MZF1)有2 個，含有MYB 結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子(v-Myb)有2 個，CdxA有2 個，TATA 盒(TATA box)有1 個，急性髓系白血病-1a(Acute myeloid leukaemia-1a，AML-1a)有1個，RORalp 有1 個，C/EBP 有1 個，Nkx-2 有1 個，Lyf-1 有1 個，N-Myc 有1 個，熱休克因子2(heat shock factor 2，HSF2)有1 個，E2F 有1 個。CSE 基因啟動子的生物信息學(xué)分析結(jié)果(表2)。

表2 CSE 基因啟動子的生物信息學(xué)分析Table 2 Results of the bioinformatics analysis of CSE gene promoter

2.3 小鼠CSE 啟動子的活性測定

報(bào)告基因分析是通過瞬時轉(zhuǎn)染培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)基中的來進(jìn)行的。用倍數(shù)關(guān)系表示CSE 基因啟動子的相對活性。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pGL4.12-KM1716 在HEK-293 細(xì)胞和COS-7 細(xì)胞中表達(dá)的活性，與空載體pGL4.12 在兩種細(xì)胞中的活性相比，分別是17.6±2.1 倍和12.4±1.2 倍(圖2)。結(jié)果表明，KM1716 片段具有CSE 核心啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，能夠用于哺乳動物細(xì)胞CSE 轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控方面的研究。

圖2 pGL4.12-KM1716 在HEK-293 細(xì)胞和COS-7細(xì)胞中表達(dá)的相對活性Fig 2 Relative activity of expression of pGL4.12-KM1716 in HEK-293 and COS-7 cells(±s，n=4)

3 討論

近年來，內(nèi)源性硫化氫在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等方面的生理作用，主要表現(xiàn)為參與一些疾病的病理過程，同時，其在藥物開發(fā)的前景等方面也越來越引起人們的重視［8］。硫化氫在各種心血管組織中，主要經(jīng)胱硫醚γ-裂解酶催化內(nèi)源性生成。在體循環(huán)血管、肺循環(huán)血管及其他血管組織中起著舒張血管、促進(jìn)血管新生、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖并調(diào)控其表型轉(zhuǎn)化等生物學(xué)效應(yīng)［9］。通過轉(zhuǎn)染的HEK-293 細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，小鼠CSE 基因核心調(diào)控區(qū)包括5'側(cè)翼區(qū)近端375 bp 的啟動子區(qū)(－357 ～+18)［14］。運(yùn)用pGL3 螢光素酶報(bào)告基因技術(shù)，研究了CSE 基因啟動子3.5 kb(－3 498 ～+18)瞬時轉(zhuǎn)染在RAW264.7 細(xì)胞中的活性。發(fā)現(xiàn)LPS 處理RAW264.7 細(xì)胞后，CSE 基因啟動子活性隨LPS 濃度梯度的變化而升高，但是地塞米松抑制這種效應(yīng)［13］。pGL4.12-KM1716 表達(dá)載體在HEK-293 細(xì)胞和COS-7 細(xì)胞中都具有很強(qiáng)的螢光素酶的活性(圖2A，B)，這表明小鼠CSE 基因近端啟動子在不同的哺乳動物細(xì)胞(人和小鼠等)中具有調(diào)控CSE 基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的能力。同時，發(fā)現(xiàn)小鼠CSE基因啟動子(－1 691 ～+25)存在一些重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如TATA 盒、GATA、HSF2 等，這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)可能對于CSE 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控起著重要的作用。CSE 啟動子上MZF-1 和Sp1 結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，能夠顯著地影響轉(zhuǎn)染在HEK-293細(xì)胞和COS-7 細(xì)胞中CSE 基因啟動子的活性，表明這些轉(zhuǎn)錄因子涉及到基本轉(zhuǎn)錄活性。相反地，移除AML-1a、USF-1 和N-Myc 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)共有序列，能夠增加HEK-293 細(xì)胞中CSE 基因啟動子活性，這表明這些轉(zhuǎn)錄因子具有作為抑制元件而起作用的［14］。

在心血管、炎性反應(yīng)等方面的疾病治療性研究方面，CSE 基因啟動子的研究工作具有其優(yōu)越性。本研究獲得的CSE 基因啟動子具有啟動螢光素酶基因的表達(dá)能力，這為進(jìn)一步CSE 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究奠定了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。特別要強(qiáng)調(diào)的是，CSE 基因啟動子上一些重要的轉(zhuǎn)錄因子的可能結(jié)合位點(diǎn)，存在重要的臨床研究價值(如作為藥物的作用靶標(biāo)等)，有利于深入研究其生物學(xué)功能和醫(yī)藥方面的重要作用。

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