曲學(xué)彬，劉星霞，韓晶晶，姚瑞芹，趙春華

(1.徐州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生物學(xué)系，江蘇徐州221009;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所組織工程中心，北京100005;3.徐州醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇徐州221002)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)不僅具有多向分化的潛能，而且還能夠發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)功能［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs 能夠抑制T 細(xì)胞的增殖與活化，通過調(diào)節(jié)輔助T 細(xì)胞(helper T cell，Th)1(Th1)和2(Th2)的平衡而緩解相關(guān)免疫疾病的癥狀，促進(jìn)調(diào)節(jié)性輔助T 細(xì)胞的生成而降低炎性反應(yīng)［3-4］。此外，BM-MSCs 還能夠調(diào)節(jié)近年來新發(fā)現(xiàn)的，與諸多自身免疫性疾病(如腦脊髓炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等)密切相關(guān)的Th17 的增殖和分化［5-7］，體現(xiàn)了BM-MSCs在自身免疫性疾病臨床治療上的應(yīng)用前景。然而，目前對BM-MSCs 調(diào)節(jié)Th17 功能的研究還不明確。胎兒BM-MSCs 能夠在體外促進(jìn)人Th17 的增殖與分化［5］，然而，BM-MSCs 能夠通過抑制Th17 的分化生成而緩解自身免疫性疾病［6-7］。因此，BM-MSCs 調(diào)控Th17 分化的作用及其機(jī)制仍需深入研究。

本研究將BM-MSCs 與CD4+初始T 細(xì)胞(CD4+na?ve T cell，Th0)體外共培養(yǎng)以觀察其對Th0 分化為Th17 的作用，為研究BM-MSCs 調(diào)控Th17 分化的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級5 ～6 周齡雄性BALB/c 小鼠，體質(zhì)量20 ～25 g［中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所，合格證號:SCXK(京)2009-0007］。

1.2 試劑

小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基(Stem Cell 公司);小鼠淋巴細(xì)胞分離液(達(dá)科為公司);CD4+na?ve T 細(xì)胞分選試劑盒(美天妮公司);RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone 公司);CD3 和CD28 抗體包被珠和Trizol(Invitrogen 公司);細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-23 和TGF-β(RD 公司);抗IL-4、IFN-γ 抗體及抗IL-10、PGE2 中和抗體(NA-IL-10、NAPGE2)、ELISA 試劑盒、透膜固定試劑盒(BD 公司);熒光標(biāo)記的抗小鼠CD4、IL-17 流式抗體(eBioscience 公司);RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根公司);SYBR Green 實時定量PCR 試劑盒(Takara 公司);抗小鼠Rorγt 抗體(CST 公司)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠BM-MSCs 的分離培養(yǎng):取小鼠骨髓，淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，培養(yǎng)于小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基，傳代培養(yǎng)至第3 代(P3)備用。

1.3.2 小鼠Th0 的分離純化及與BM-MSCs 的共培養(yǎng):取小鼠脾臟，篩網(wǎng)上研磨獲得單細(xì)胞懸液，小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離總淋巴細(xì)胞，試劑盒分選Th0，純度≥95.0%。分離純化的Th0 種植于預(yù)先鋪有BM-MSCs 的孔板中(Th0∶BM-MSCs=10∶1)，培養(yǎng)于RPMI-1640 培養(yǎng)基:含10%胎牛血清，1 mmol/L 谷氨酰胺，0.1 mmol/L β-巰基乙醇，1% 非必需氨基酸，抗CD3 和CD28 抗體包被珠，5 μg/L IL-2，20 μg/L IL-6，5 μg/L TGF-β，10 μg/L IL-23，2 mg/L抗IL-4 中和抗體(NA-IL-4)，2 mg/L NA-IFN-γ，誘導(dǎo)分化3 d。在中和抗體實驗中，同型抗體、NAIL-10以及NA-PGE2 的終濃度均為10 mg/L。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測CD4+IL-17+細(xì)胞:誘導(dǎo)3 d的培養(yǎng)體系中加入佛波酯、離子霉素和莫能霉素處理細(xì)胞3 h。收集誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，用含0.5%牛血清白蛋白的PBS 冰上封閉5 min，加入熒光標(biāo)記的抗CD4抗體冰上孵育20 min，透膜固定試劑盒處理細(xì)胞后，加入熒光標(biāo)記的抗IL-17 抗體冰上孵育20 min，洗滌后Accuri C6 流式細(xì)胞儀檢測，CFlow 軟件分析。

1.3.4 培養(yǎng)上清細(xì)胞因子檢測:收集誘導(dǎo)3 d 的培養(yǎng)上清，離心去細(xì)胞碎片，采用ELISA 試劑盒檢測IL-10、IL-17 和PGE2 的水平。

1.3.5 qRT-PCR 檢測Rorγt 的mRNA 水平:Trizol法提取誘導(dǎo)3 d 的細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，采用SYBR Green 實時定量PCR 試劑盒在IQ5 儀器上檢測。Rorγt 上游引物，5'-TGCAAGACTCATCGAC AAGG-3'，下游引物:5'-AGGGGATTCAACATCAGTG C-3';β-actin 上游引物，5'-GAGACCTTCAACACCCC AGCC-3'，下游引物，5'-AATGTCACGCACGATTTCC C-3'。數(shù)據(jù)處理采用2-△△ct法。

1.3.6 Western blot 檢測Rorγt 的蛋白表達(dá):誘導(dǎo)3 d的細(xì)胞經(jīng)RIPA 裂解后提取總蛋白。變性后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉后一抗4 ℃孵育過夜，HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，ECL 發(fā)光檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BM-MSCs 分泌高水平的TGF-β 和IL-6

原代分離的小鼠BM-MSCs 傳代培養(yǎng)至P3 時，形態(tài)均一，多呈現(xiàn)典型的梭形或多角形(圖1A)。ELISA 檢測結(jié)果表明，P3 BM-MSCs 分泌高水平細(xì)胞因子TGF-β 和IL-6，分泌少量促炎因子IFN-γ 和TNF-α，以及抑炎因子IL-10 和PGE2(圖1B)。

2.2 BM-MSCs 抑制Th17 的體外誘導(dǎo)分化

由于TGF-β 和IL-6 是誘導(dǎo)Th0 分化為Th17的關(guān)鍵細(xì)胞因子，因此我們共培養(yǎng)BM-MSCs 和Th0 以觀察BM-MSCs 對Th17 分化的作用。與對照組(無BM-MSCs)相比，BM-MSCs 明顯降低CD4+IL-17+Th17 的生成率(圖2A)，減少IL-17的分泌量(圖2B)，減弱關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Rorγt 的表達(dá)水平(圖2C，D)。

2.3 IL-10 和PGE2 介導(dǎo)了BM-MSCs 對Th17 分化的抑制作用

共培養(yǎng)組IL-10 和PGE2 濃度隨誘導(dǎo)天數(shù)的增加而逐漸上升，明顯高于同期對照組(P＜0.05)(圖3)。共培養(yǎng)體系中加入NA-IL-10 或NA-PGE2 后，明顯提升CD4+IL-17+Th17 的生成率(圖4A)，提高IL-17 分泌水平(圖4B)，增強(qiáng)Rorγt 的表達(dá)量(圖4C，D)。而且，同時加入NA-IL-10 和NA-PGE2 能進(jìn)一步提高Th17 的分化生成率(圖4)。因此，共培養(yǎng)體系中IL-10 和PGE2 介導(dǎo)了BM-MSCs 對Th17分化的抑制作用。

圖1 小鼠BM-MSCs 形態(tài)及細(xì)胞因子分泌譜分析Fig 1 Analysis of mouse BM-MSCs morphology and cytokines secretion (±s，n=3)

3 討論

本實驗首先對小鼠BM-MSCs 的細(xì)胞因子分泌譜進(jìn)行了分析，在結(jié)果中有兩個濃度非常高的細(xì)胞因子引起了關(guān)注，即TGF-β 和IL-6。由于TGF-β和IL-6 是體外誘導(dǎo)Th0 分化為Th17 必需的細(xì)胞因子［8］，由此推測小鼠BM-MSCs 能夠促進(jìn)Th17 的分化成熟。然而，Th0 和BM-MSCs 共培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示BM-MSCs 不僅沒有促進(jìn)Th17 的生成，反而起抑制作用。鑒于此，本實驗通過細(xì)胞因子的中和抗體研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)體系中的IL-10 和PGE2 能夠抑制Th17 的分化生成，其作用機(jī)制可能是阻斷了TGF-β 和IL-6 活化Th17 分化的信號通路。

圖2 BM-MSCs 對Th17 體外分化的影響Fig 2 Effect of BM-MSCs on the Th17 differentiation in vitro(±s，n=3)

圖3 共培養(yǎng)體系中IL-10 和PGE2 濃度檢測Fig 3 Concentration of IL-10 and PGE2 in the supernatant of co-culture system (±s，n=3)

研究發(fā)現(xiàn)，抑炎因子IL-10 和PGE2 在Th17 分化生成的過程中發(fā)揮了重要的抑制作用。IL-10能夠抑制Th0 分化為Th17［7］，且對Th17 誘發(fā)的自身免疫性疾病具有治療效果［9］。特異性地阻斷T細(xì)胞中IL-10 的信號通路可以誘發(fā)機(jī)體IL-17+Th17 數(shù)量上升［10］。IL-10 通過活化JAK-STAT5 上調(diào)T 細(xì)胞中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SOCS3 的表達(dá)，進(jìn)而阻斷IL-6 的信號通路，從而抑制Th17 分化［7］。此外，PGE2 也能夠通過結(jié)合EP4 受體而抑制Th17分化［11］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)雖然BM-MSCs 分泌高水平的TGF-β 和IL-6，有促進(jìn)Th17 分化的可能，但同時BM-MSCs 也分泌多種抑炎因子，如IL-10和PGE2 等，阻斷了IL-6 的信號傳導(dǎo)途徑，最終導(dǎo)致對Th17 分化的抑制。然而，BM-MSCs 抑制Th17 分化的具體機(jī)制仍需深入研究，以期為BM-MSCs 應(yīng)用于自身免疫性疾病臨床治療奠定基礎(chǔ)。

圖4 NA-IL-10 和NA-PGE2 對共培養(yǎng)體系中Th17 分化的影響Fig 4 Effect of NA-IL-10 and NA-PGE2 on the Th17 differentiation in the co-culture system (±s，n=3)

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