王雅娟，胡 潔，趙海燕，韓慧霞

(南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系，廣東廣州510515)

上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與非EMT 細(xì)胞是共同完成自發(fā)轉(zhuǎn)移的過程，由EMT 細(xì)胞負(fù)責(zé)降解細(xì)胞周圍的基質(zhì)，為非EMT 細(xì)胞鋪平了侵襲轉(zhuǎn)移的道路［1］。此觀點與以往認(rèn)為的發(fā)生EMT 的腫瘤細(xì)胞，其侵襲性比非EMT細(xì)胞強有不同之處。那么在大腸癌中發(fā)生EMT 的細(xì)胞與非EMT 細(xì)胞之間是否也存在這樣的協(xié)同合作關(guān)系呢?本實驗使用轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)長期誘導(dǎo)大腸癌HT29 細(xì)胞使之發(fā)生EMT，將EMT與非EMT 的細(xì)胞混合培養(yǎng)，探討兩者在轉(zhuǎn)移過程中是否存在協(xié)同關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TGF-β1(Peprotec 公司);RPMI1640 培養(yǎng)基(萊德爾生物公司);新生牛血清(吉泰公司);Trizol 試劑(南京凱基公司);反轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription System)試劑盒和熒光定量(SYBR Premix ExTaqTM)試劑盒(TaKaRa 公司);E-鈣黏素(Ecadherin)、波形蛋白(Vimentin)和GAPDH 引物(上海英駿公司合成)。綠色熒光蛋白質(zhì)粒(GFP)和紅色熒光蛋白質(zhì)粒(RFP)(Santa Cruz 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):人大腸癌細(xì)胞系HT29 為本室冷凍保存;采用含20%新生牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，至37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用10－5g/L濃度的TGF-β1 連續(xù)刺激HT29 細(xì)胞［2-3］。

1.2.2 RT-PCR 檢測:10－5g/L TGF-β1 連續(xù)刺激10 d后HT29 中Ecadherin 和Vimentin 的表達

1)RNA 的提取:參照說明書，用Trizol 試劑常規(guī)提取細(xì)胞總RNA。

2)cDNA 第1 鏈的合成:按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)總體系為20 μL，其中樣品總RNA 2 μL，5 × PrimeScript 4 μL，Prime-ScriptTMRT Enzyme Mix Ⅰ1 μL，Random 6 mers 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，DEPC 水11 μL。37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃滅活5 s。

3)Real-time PCR:看家基因GAPDH 為內(nèi)對照。通過相對熒光定量PCR 方法，同時對Ecadherin、Vimentin和GAPDH 進行檢測，計算出不同樣本的Ecadherin、Vimentin 的相對表達量(表1)。

表1 Ecadherin、Vimentin和GAPDH 基因引物序列Table 1 Primer sequence of Ecadherin，Vimentin and GAPDH length(bp)

應(yīng)用Mx7500P 定量PCR 儀進行real-time PCR實驗，反應(yīng)條件為95 ℃5 s，60 ℃20 s，72 ℃10 s，40 個循環(huán)，熒光信號監(jiān)測。以Folds =2－ΔΔCt表示實驗組與對照組目的基因表達的倍數(shù)比關(guān)系，公式如下2－ΔΔCt=［Ct(target gene)－Ct(GAPDH)］實驗組－［Ct(target gene)－Ct(GAPDH)］對照組［4］。重復(fù)3 次實驗，計算平均值，Ct 值越小，表示起始拷貝數(shù)越多。

1.2.3 觀察細(xì)胞形態(tài):用10－5g/L 濃度的TGF-β1連續(xù)刺激HT29 細(xì)胞40 d 后，光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。首先制作細(xì)胞爬片，PBS 洗滌3 次，95%乙醇固定10 min后PBS 洗滌3 次，常規(guī)蘇木素，伊紅染色，逐級乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.2.4 考馬斯亮藍染色觀察刺激40 d 后HT29 細(xì)胞骨架:培養(yǎng)細(xì)胞爬片，PBS 洗滌3 次，每次5 min，95%乙醇固定10 min 后PBS 洗滌3 次，4 min/次，1.5%Triton 振蕩洗滌3 次，8 min/次，PBS 洗滌3 次，5 min/次，考馬斯亮藍染液染色40 min，PBS 洗去多余的染液，空氣干燥，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.2.5 細(xì)胞的劃痕實驗:將細(xì)胞接種于24 孔培養(yǎng)板中，形成細(xì)胞單層，培養(yǎng)20 h 后用10 μL 移液器滴頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字型劃痕單層培養(yǎng)細(xì)胞，顯微鏡下記錄劃痕區(qū)相對距離，繼續(xù)培養(yǎng)48 或72 h，倒置顯微鏡下觀察并照相記錄。

1.2.6 熒光標(biāo)記EMT 細(xì)胞和非EMT 化細(xì)胞遷移實驗:RFP 轉(zhuǎn)染刺激前HT29 細(xì)胞，GFP 轉(zhuǎn)染刺激后HT29 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1 天將細(xì)胞接種至24 孔板中，細(xì)胞1 ×105個/孔，培養(yǎng)24 h 后使細(xì)胞鋪滿瓶壁生長。轉(zhuǎn)染前用不含血清的RPMI1640 培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞兩遍后，加入轉(zhuǎn)染試劑，至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4 h 后更換完全培養(yǎng)基。24 h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染20 h 后，直接用自然力分別吹打兩種細(xì)胞，使細(xì)胞脫落，將兩種細(xì)胞混合培養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行處理，實時熒光定量PCR 檢測TGF-β1 刺激HT29 細(xì)胞前后的Ecadherin、Vimentin 的mRNA 表達水平均采用兩樣本t 檢驗的統(tǒng)計學(xué)方法。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1 連續(xù)刺激10 d 后HT29 中Ecadherin和Vimentin mRNA 的表達

2.1.1 總RNA 的提取:電泳檢測有3 條清晰的rRNA 帶，28S，18S 和5S，說明RNA 無降解(圖1)。

2.1.2 統(tǒng)計學(xué)分析:HT29 經(jīng)10－5g/L TGF-β1 連續(xù)刺激10 d 后，Ecadherin Ct 值由4.77 ±0.16 變?yōu)?.57 ±0.44，表達顯著下降(P＜0.05);Vimentin Ct 值由14.96±0.32 變?yōu)?4.05 ±0.23，表達顯著上調(diào)(P＜0.05)。

2.2 光鏡下觀察經(jīng)TGF-β1 連續(xù)刺激40 d 后的HT29 細(xì)胞

刺激前的HT29 細(xì)胞呈橢圓形，匯合性生長，細(xì)胞間的黏附作用強;刺激后的細(xì)胞形態(tài)較之前變梭，生長較分散，細(xì)胞之間的連接不緊密(圖2)。

圖1 細(xì)胞總RNA 瓊脂糖凝膠電泳Fig 1 Agrose gel electrophoresis of total RNA from colorectal cancer cell lines

圖2 細(xì)胞HE 染色Fig 2 Cell morphology(HE×400)

2.3 光鏡和考馬斯亮藍染色觀察經(jīng)TGF-β1 連續(xù)刺激后的HT29 細(xì)胞

刺激后的HT29 細(xì)胞藍色絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的骨架蛋白明顯增多，相鄰細(xì)胞間骨架連接不如刺激前緊密(圖3)。

2.4 劃痕實驗結(jié)果

HT29 細(xì)胞成匯合生長，遷移速度不及刺激后的HT29 細(xì)胞，兩者混合培養(yǎng)后，混合細(xì)胞的遷移速度比HT29 快，但比刺激后的HT29 細(xì)胞稍慢，在遷移速度較快的細(xì)胞中圓形和梭形的細(xì)胞均能見到(圖4)。

2.5 熒光標(biāo)記EMT 細(xì)胞和非EMT 化細(xì)胞遷移實驗

自然力吹打細(xì)胞混合培養(yǎng)，劃痕48 h 后見紅、綠色細(xì)胞分布均勻(圖5)。

圖3 細(xì)胞考馬斯亮藍染色Fig 3 Observation of cytoskeletal protein by Coomassie blue staining(×400)

圖4 劃痕實驗Fig 4 Scratches test

圖5 劃痕后48 h 混合培養(yǎng)的細(xì)胞Fig 5 Co-culturing two kind of cells，scratches，after 48 hours(×100)

3 討論

TGF-β1 是一種誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT 的微環(huán)境細(xì)胞因子，能引起腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、運動和侵襲能力的改變［5］。HT29 細(xì)胞來源于人大腸癌原發(fā)灶，在前期實驗中，本研究發(fā)現(xiàn)HT29 的上皮標(biāo)志E-cadherin表達很高，間質(zhì)標(biāo)志Vimentin 幾乎不表達，具有上皮細(xì)胞的特征，因此本研究中使用TGF-β1連續(xù)刺激HT29 細(xì)胞，使之發(fā)生EMT。文獻報道發(fā)生EMT 的細(xì)胞喪失上皮表型的同時獲得間質(zhì)表型［6-7］。本實驗中經(jīng)過TGF-β1 刺激后的HT29 細(xì)胞Ecadherin表達下降，Vimentin 表達上調(diào)。隨后的形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)刺激后的細(xì)胞較未刺激的細(xì)胞變梭，生長較分散;并且刺激后的細(xì)胞骨架蛋白明顯增多，相鄰細(xì)胞連接不如刺激前緊密，說明細(xì)胞間相互作用減少，遷移和運動能力增強。以上實驗結(jié)果均說明HT29 在使用TGF-β1 連續(xù)刺激后，發(fā)生了EMT。

EMT 可導(dǎo)致大腸癌細(xì)胞侵襲力增強［7-11］。有文獻報道當(dāng)將EMT 化和非EMT 化的腫瘤細(xì)胞混合皮下注射到鼠體內(nèi)成瘤時，兩種細(xì)胞都能滲入到血管中，非EMT 化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到了肺組織。認(rèn)為EMT 化與非EMT 化的細(xì)胞共同完成了轉(zhuǎn)移，EMT 化細(xì)胞通過降解細(xì)胞周圍基質(zhì)和血管壁，為非EMT 化細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移鋪平道路。此觀點與以往所認(rèn)為的EMT 化的腫瘤細(xì)胞，其遷移能力強于非EMT 化的細(xì)胞有不同之處［1］。

本研究將EMT 化與非EMT 化的細(xì)胞混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)混合后細(xì)胞的遷移速度比非EMT 化細(xì)胞快，但比EMT 化細(xì)胞慢，在遷移較快的細(xì)胞中不單能見到梭形的EMT 化細(xì)胞，也能見到偏圓形的非EMT 化細(xì)胞。說明EMT 化與非EMT 化的細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移中可互相影響。隨后將紅色和綠色熒光蛋白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染非EMT 化和EMT 化的細(xì)胞后，混合培養(yǎng)兩種轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進行劃痕實驗。由于兩種細(xì)胞的發(fā)光數(shù)量較少，無法顯示所有細(xì)胞的運動狀態(tài)進而精確定位，但觀察到遷移較快的細(xì)胞中兩種細(xì)胞均有，表明當(dāng)有EMT 化的腫瘤細(xì)胞存在時，有利于非EMT 化的腫瘤細(xì)胞遷移。推測TGF-β1 刺激HT29 發(fā)生EMT 后，其可能通過某種途徑改變周圍的環(huán)境，以利于腫瘤細(xì)胞，包括非EMT 化細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，又或是因為混合培養(yǎng)后EMT 化與非EMT化的細(xì)胞之間有連接，EMT 化細(xì)胞“拖動”非EMT化細(xì)胞運動。但具體的機制還需要進一步研究探討。

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