姜峰 王志龍 王巧云 申玉星

(1.華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東廣州510640;2.廣州計量檢測技術(shù)研究院，廣東廣州510030)

Dodds［1］于1938年首次合成了雙烯雌酚(Dienestrol，DIEN)，隨后人們又對其合成制備［2］、電子密度［3］和生物代謝效應(yīng)［4］等進行了詳細的研究.雙烯雌酚作為一種常見的人工合成非甾類雌激素，從20世紀(jì)60年代起作為重要的生長促進劑，曾經(jīng)廣泛使用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)，以促進動物蛋白質(zhì)沉積和快速增重［5-7］.相對于天然雌激素，合成雌激素較為穩(wěn)定，易在動物脂肪和組織內(nèi)殘留，進而通過食物鏈危害人類健康［8］.

由于此類激素存在潛在致癌和致畸風(fēng)險［9-11］，歐盟相關(guān)法規(guī)96/22/EC已禁止將其用于畜牧生產(chǎn)，并對其在動物性食品中的殘留進行監(jiān)控;我國也出臺了多項標(biāo)準(zhǔn) (GB/T 20766—2006，GB/T 20767—2006等)嚴(yán)格控制其在食品中的殘留.由于雙烯雌酚的檢測方法繁雜而多樣［12-13］，因此，雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的開發(fā)和使用對保證臨床檢驗、食品安全、環(huán)境保護等相關(guān)檢測的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性具有重要意義.文中介紹了雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制過程，對雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的物化性質(zhì)進行了分析，并對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度進行了詳細評定.

1 實驗

1.1 主要儀器與試劑

1200型高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器)、7890A型氣相色譜儀(配火焰離子化檢測器)，ZORBAX Eclipse XDB-C18 9.4 mm×250 mm×5 μm型半制備液相色譜柱，美國 Agilent公司生產(chǎn);Bru ker/Agilent 1290-microTOF QII型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，德國 Bruker公司/美國 Agilent公司生產(chǎn); 400MHz核磁共振儀，德國 Bruker公司生產(chǎn);Spectrum Two型紅外光譜儀，美國珀金埃爾默儀器(上海)有限公司生產(chǎn);831 KF型卡氏水分儀，瑞士萬通公司生產(chǎn);AAF11/18型馬弗爐，英國Carbolite公司生產(chǎn);雙烯雌酚原料，上海紫一試劑廠生產(chǎn);乙腈，德國MERK公司生產(chǎn)，色譜純;其他試劑均為分析純;實驗用水為二次去離子水.

1.2 雙烯雌酚高純原料化合物的制備

采用半制備高效液相色譜法通過多次制備得到雙烯雌酚高純原料化合物.將雙烯雌酚原料(HPLC歸一化法純度約為94.00%)于乙腈中超聲溶解，配制成質(zhì)量濃度為35 g/L的樣品備用;再經(jīng)半制備型HPLC制備分離，收集保留時間10.0～12.0 min的餾分，離心旋蒸濃縮，冷凍干燥得到白色粉末;將制備得到的化合物作為雙烯雌酚高純原料化合物.半制備色譜條件:ZORBAX Eclipse XDB-C18 9.4mm× 250mm×5 μm型半制備型色譜柱，柱溫為室溫，檢測波長230nm，流速4mL/min，流動相為乙腈與水體積比為1∶1的混合液，進樣量100 μL，分析時間16min，進樣方式為Agilent標(biāo)準(zhǔn)自動進樣器自動進樣;收集方式為手動收集.

1.3 雙烯雌酚高純原料化合物的定性分析

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，核磁共振氫譜、碳譜法和紅外光譜法對制得的原料化合物進行定性分析.

1.4 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中有機主成分含量的測定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范ISO Guide 34和ISO Guide 35的要求，選用高效液相色譜法并聯(lián)合多家實驗室對雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的有機主成分含量進行測定.通過實驗優(yōu)化，在保證分離的前提下，選擇雜質(zhì)與主體成分吸收都比較好的波長作為檢測波長.實驗采用 Agilent 1200型液相色譜儀，ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6 mm×250 mm×5μm色譜柱，流動相為乙腈與水體積比為70∶30的混合液，檢測器為二極管陣列檢測器(DAD)，檢測波長為220、230、239、260nm，定值波長為230nm.共有7家實驗室參加，每家實驗室7瓶樣品(每瓶樣品測量3次，所有純度結(jié)果均為HPLC歸一化結(jié)果)，每家實驗室分別給出1-7瓶樣品的測量平均值.

1.5 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制相關(guān)技術(shù)規(guī)范，抽取15個包裝，做瓶間和瓶內(nèi)均勻性檢驗(每個包裝樣品測3次).實驗采用Agilent 1200型液相色譜儀，ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6mm×250mm×5μm色譜柱流動相為乙腈與水體積比為70∶30的混合液，檢測器為二極管陣列檢測器(DAD)，檢測波長為230nm.

1.6 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗

穩(wěn)定性檢驗按先密后疏的原則，取6個包裝，每個包裝測量3次，取平均值，得到穩(wěn)定性檢驗時間點純度含量數(shù)據(jù).實驗條件同1.5節(jié)。

1.7 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中水分、金屬元素、灰分及揮發(fā)性物質(zhì)含量的分析

采用卡氏水分儀(卡爾費休容量法)測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的水分含量，測量10次取平均值;采用ICPOES測定Al、As、Ba、Be、B、Cd、Ca、Ce、Cs、Cr、Co、Cu、Dy、Er、Eu、Gd、Ga、Ho、Fe、La、Pb、Lu、Mg、Mn、Nd、Ni、P、K、Pr、Rb、Sm、Se、Ag、Na、Sr、S、Tl、Th、Tm、U、V、Yb共42種無機金屬元素的含量;采用GCFID檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的揮發(fā)性物質(zhì);采用灼燒灰化質(zhì)量差法測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的灰分含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 雙烯雌酚高純原料化合物的定性分析結(jié)果

雙烯雌酚高純原料化合物的質(zhì)譜圖如圖1所示.由圖1可見，目標(biāo)組分分子離子峰(M+H)+的質(zhì)荷比m/z為267.1284，非常接近于雙烯雌酚相對分子質(zhì)量(266.1307)加上氫原子量(1.0000)，由此可以確定雙烯雌酚高純原料化合物與雙烯雌酚具有相同的分子質(zhì)量.

圖1 雙烯雌酚高純原料化合物的質(zhì)譜圖Fig.1 MS spectrum of high-purity raw material of dienestrol

雙烯雌酚高純原料化合物的1HNMR和13CNMR譜如圖2所示.通過對1HNMR譜圖的分析，發(fā)現(xiàn)有5組化學(xué)環(huán)境不同的特征氫，它們與雙烯雌酚的氫原子個數(shù)和空間耦合關(guān)系完全相符.通過對13CNMR譜圖的分析，7組碳原子的數(shù)量與化學(xué)位移同雙烯雌酚完全相符.

圖2 雙烯雌酚高純原料化合物的1HNMR和13CNMR譜圖Fig.2 1HNMR and13CNMR spectra of high-purity raw material of dienestrol

最后通過雙烯雌酚高純原料化合物和雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的紅外光譜圖(見圖3(a)和3(b))的比較，再次確認(rèn)雙烯雌酚高純原料化合物為目標(biāo)化合雙烯雌酚，結(jié)構(gòu)式如圖4.

圖4 雙烯雌酚的分子結(jié)構(gòu)Fig.4 Molecular structure of dienestrol

2.2 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中有機主成分含量的測定結(jié)果

采用高效液相色譜法并聯(lián)合多家實驗室對雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中有機主成分的含量進行測定，并分別利用柯克倫檢驗［9］和狄克遜檢驗［9］對7家實驗室的數(shù)據(jù)進行檢驗，結(jié)果如表1所示.由表1所示結(jié)果可知實驗數(shù)據(jù)無可疑值，由多家實驗室合作測量確定的雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的有機主成分的含量為99.52%.

表1 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有機主成分含量的多實驗室合作測定結(jié)果Table 1 Multi-lab measurement results of organic principal components in certified reference material for purity determination of dienestrol

2.3 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最基本的屬性，是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值在空間分布一致程度的表征.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性通常用差方分析法來檢驗.具體檢驗方法如下:

通過隨機抽取一定數(shù)量的樣品，采用相同的試驗方法，在同樣的實驗條件下得m組等精度測量數(shù)據(jù)如下:

(m)xm1，xm2，…，xmnm，平均值;

表2 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗結(jié)果Table 2 Homogeneity testi results of certified reference material for purity determinootion of dienestrol

2.4 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

根據(jù)測得的純度含量數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度特性量值隨時間變化的圖，擬合回歸曲線，用該曲線斜率的顯著性來評估標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性，該方法為趨勢分析法.分析方法如下:設(shè)時間對特性量值的直線方程為y=b0+b1x，斜率分別是時間與特性量值.截距;直線的標(biāo)準(zhǔn)偏差，斜率的標(biāo)準(zhǔn)偏差(即斜率的不確定度);當(dāng)置信度水平取95%時，－0＜t0.95，n－2·s(b1)，表明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性良好.穩(wěn)定性檢驗結(jié)果如表3所示，從表中數(shù)據(jù)看，在1年時間內(nèi)，檢測數(shù)據(jù)組間和各時間點數(shù)據(jù)無顯著性差異，雙烯雌酚的純度值變化差異不大.經(jīng)趨勢分析，時間與特性量值的回歸趨勢線的斜率b1為 -0.000 279 0，t0.95，n-2·s(b1)為0.003 141，即︱b1︱＜t0.95，n-2·s(b1)，因此斜率估計值不顯著，表示雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度沒有發(fā)生顯著性變化.穩(wěn)定性引入的不確定度為ustable=0.012%.

表3 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定檢驗結(jié)果Table 3 Stability test results of certified reference material for purity determination of dienestrol

2.5 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中水分、金屬元素、灰分及揮發(fā)性物質(zhì)含量的分析結(jié)果

經(jīng)測定，雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中水分含量為0.03000%，灰分含量為0.001000%，Al、As、Ba、Be、B、Cd、Ca、Ce、Cs、Cr、Co、Cu、Dy、Er、Eu、Gd、Ga、Ho、Fe、La、Pb、Lu、Mg、Mn、Nd、Ni、P、K、Pr、Rb、Sm、Se、Ag、Na、Sr、S、Tl、Th、Tm、U、V、Yb等共42種無機金屬元素含量為0.00007900%，未檢出雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中含有無紫外吸收的揮發(fā)性物質(zhì).

3 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度評定

［15］中的方法對雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行不確定度評定.主要的不確定度來源于多家實驗室聯(lián)合測定雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時的有機主成分含量以及均勻性與穩(wěn)定性檢驗，在此基礎(chǔ)上最終合成了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度.

3.1 有機主成分含量測定引入的不確定度

多家實驗室聯(lián)合測定雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的有機主成分含量時所引入的不確定度由3部分組成:將合作實驗室的平均值作為一組新的測量值，該組測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差作為不確定度來源之一，即u1=0.27%;多家合作測量所用的方法的重復(fù)性，取各家測量結(jié)果中最大的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，即u2= 0.045%;合作測量所用的方法(即液相色譜法)的響應(yīng)因子引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3.u3按下式進行量化:

u3-i=Rimax，-Riset，，

其中，Rimax，表示各組分在不同波長下的最大響應(yīng)值，Riset，表示目標(biāo)組分在設(shè)定的檢測波長下的響應(yīng)值，i表示檢測波長.

假設(shè)由各組分在不同波長下的響應(yīng)差異引入的不確定度呈均勻分布，則u3可計算如下:

雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在不同波長下的檢測結(jié)果如表4所示.由表4所示結(jié)果計算可得u3=0.11%.

表4 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在不同波長下的檢測結(jié)果Table 4 Test results at different wavelengths of purity certified reference material for purity determination of dienestrol

3.2 相對合成不確定度

由于雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的水分、灰分、無機元素、揮發(fā)性物質(zhì)含量均小于0.1%，其不確定度可忽略不計.因此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的最終不確定度由3部分組成，即:標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中有機主成分含量測定所引入的不確定度(u1，u2，u3)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性引入的不確定度ueven和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度ustable.

雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對合成不確定度按下式計算:

將u1、u2、u3、ueven、ustable的取值代入式中計算得u=0.30%.

3.3 相對擴展不確定度

雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對擴展不確定度計算如下:

3.4 雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果

雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的最終純度由質(zhì)量平衡法來確定.質(zhì)量平衡法要求首先確定樣品中各種雜質(zhì)的含量，包括非揮發(fā)性雜質(zhì)(有機雜質(zhì))、水分、揮發(fā)性溶劑和灼燒殘渣等，再從總物質(zhì)中減去上述雜質(zhì)得到該物質(zhì)的含量，可以直接溯源到國際單位制(SI)中質(zhì)量單位(kg)，是一種潛在的基準(zhǔn)方法［16］.

文中測定的雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中有機主成分含量(Po)為99.52%，水分含量(Xw)為0.03000%，灰分含量(Xa)為0.001 000%，無機金屬元素含量(Xe)為0.00007900%，揮發(fā)性物質(zhì)(Xv)含量為0.根據(jù)質(zhì)量平衡法確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最終純度為

修約為99.4%.

故此，文中研制的雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為99.4%，擴展不確定度為0.6%(k=2).

4 結(jié)論

文中通過半制備高壓液相色譜法制備了雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、核磁共振氫譜、碳譜法和紅外光譜法對制得的原料化合物進行了定性分析，采用多家實驗室聯(lián)合定值法對雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的有機主成分含量進行了測定，對雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性、穩(wěn)定性、水分含量、灰分含量、揮發(fā)性物質(zhì)含量、無機金屬元素含量進行了分析，并對雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度進行了評定，得出以下主要結(jié)論:

(1)研制的雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好

(2)1年內(nèi)，研制的雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度變化不大，穩(wěn)定性較好;

(3)研制的雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的水分、灰分、無機元素、揮發(fā)性物質(zhì)含量均小于0.1%;

(4)研制的雙烯雌酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為99.4%，擴展不確定度為0.6%(k=2).

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