范雪梅,徐惠成,王朝麗

(1.成都軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科,成都 610083；2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 400038；3.中國(guó)人民解放軍324醫(yī)院體檢中心,重慶 400020)

近年來(lái),隨著材料科學(xué)和組織工程學(xué)的進(jìn)步,脫細(xì)胞基質(zhì)成分的組織工程補(bǔ)片大量涌現(xiàn)，并逐漸在盆底修復(fù)重建手術(shù)中采用，替代薄弱受損的盆底筋膜組織[1]。膀胱損傷后能迅速進(jìn)行自我修復(fù)，用膀胱基質(zhì)修復(fù)受損組織是合乎邏輯的選擇[2]。目前，脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)(acellular bladder matrix，ABM)已成為泌尿外科研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)，但還未見其用于盆底修復(fù)方面的報(bào)道。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用表面活性劑聯(lián)合酶消化法[3-5]，對(duì)新鮮健康豬膀胱(屠宰場(chǎng)獲取)進(jìn)行脫細(xì)胞處理，制成 ABM補(bǔ)片，采用體內(nèi)外相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)生物相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為其在盆底修復(fù)方面的應(yīng)用進(jìn)一步提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康新西蘭大白兔15只,體質(zhì)量2.1～2.5 kg,雌性；由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用合格證:SCXK(渝)2007-0002。

1.2儀器與試劑 苯甲基磺酰氟(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司),三羥甲基氨基甲烷(BBI)，Triton X-100、DNA酶及RNA酶(上海生工有限公司)，十二烷基硫酸鈉(捷瑞生物工程有限公司)，苯酚(北京化工廠)，聚丙烯網(wǎng)片( 美國(guó)強(qiáng)生公司)。凍干機(jī)，掃描電鏡，CO2培養(yǎng)箱，CK2型倒置相差顯微鏡，BIO-RAD 680 XR型酶標(biāo)儀。

1.3方法

1．3．1材料浸提液制備 參照ISO10993-5(2009)[6]，浸提介質(zhì)為RPMI1640培養(yǎng)液，浸提比例為6 cm2/mL，培養(yǎng)液完全浸沒樣品，密封后在37 ℃無(wú)菌條件下浸泡24 h制成浸提液。完成后用RPMI1640培養(yǎng)液分別稀釋，制備100.0%、50.0%、25.0%、12.5%的浸提液，放入冰箱4 ℃保存(實(shí)驗(yàn)組)?？瞻讓?duì)照組： RPMI1640培養(yǎng)液。陰性對(duì)照組：聚苯乙烯(浸提方法同試驗(yàn)樣品)。陽(yáng)性對(duì)照組：含0.5%苯酚溶液(由RPMI1640培養(yǎng)液配置)。

1．3．2細(xì)胞毒性試驗(yàn) 凍存 L-929 細(xì)胞復(fù)蘇后經(jīng)過(guò)兩次傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化2～3 min。倒去消化液，RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋至1×105個(gè)/mL。將L929細(xì)胞懸液加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液，按實(shí)驗(yàn)分組分別進(jìn)行換液(每組5孔)，再把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，于1、3、5 d各取出一塊培養(yǎng)板，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、照相，每孔加入MTT染色劑50 μL(1 mg/mL)，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。吸盡原液，每孔加入100 μL異丙醇，吹打震蕩，充分混勻，用酶標(biāo)儀以檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm，參考波長(zhǎng)630 nm，分別測(cè)定各孔OD值。并根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR)=供試品組(陰性、陽(yáng)性組) OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(RGR≥100%為0級(jí)，75%～99%為1級(jí)，50%～74%為2級(jí)，25%～49%為3級(jí)，1%～24%為4級(jí)，0%為5級(jí)),對(duì)樣品細(xì)胞毒性程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1．3．3溶血試驗(yàn) 參照ISO10993-4(2009)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。采集新西蘭兔血2 mL與1 mL肝素混合，并加1.5 mL生理鹽水稀釋備用。設(shè)實(shí)驗(yàn)組(ABM生理鹽水100%浸提液)；陰性對(duì)照組(生理鹽水)；陽(yáng)性對(duì)照組(蒸餾水)各5 mL,每組5支試管。每支試管加入稀釋的抗凝兔血0.1 mL，37 ℃孵育60 min。離心10 min(3 000 r/min)，觀察上層液體顏色及紅細(xì)胞沉積情況。酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)OD值，計(jì)算溶血率，溶血率=[待測(cè)OD值 (Dt)-陰性對(duì)照組OD值(Dnc)]/[陽(yáng)性對(duì)照OD組(Dpc)-Dnc]×100%。

1．3．4陰道埋植試驗(yàn) 新西蘭大白兔10只,雌性，未孕未產(chǎn)。分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。采用3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉,陰道消毒,剪開陰道直腸交界處皮膚，分離陰道后壁黏膜與直腸間隙，達(dá)頂點(diǎn)處，長(zhǎng)約2.0～2.5 cm[7]。ABM裁剪成10 mm×20 mm大小植入實(shí)驗(yàn)組家兔陰道后壁黏膜下方，將目前臨床上最常用于盆底修復(fù)的人工合成材料聚丙烯網(wǎng)片[8]剪成同樣大小植入另一組家兔陰道作對(duì)照。術(shù)后每天觀察手術(shù)切口及動(dòng)物反應(yīng)變化，于12周處死動(dòng)物后采集樣本(植入材料及表面附著組織),甲醛固定，石蠟包埋,伊紅-蘇木素染色制成病理切片，在光鏡下觀察炎癥反應(yīng)、新生血管形成和成纖維細(xì)胞增殖情況。

2 結(jié) 果

2．1細(xì)胞毒性試驗(yàn) 倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)1 d后(圖1)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)良好，為長(zhǎng)梭形或不規(guī)則三角形與陰性對(duì)照組相似；陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞無(wú)明顯生長(zhǎng)，變圓、皺縮。隨時(shí)間延長(zhǎng)可見實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，兩組相比未見明顯差異，而陽(yáng)性對(duì)照組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞死亡。染色后，實(shí)驗(yàn)組 MTT 結(jié)晶物密度與陰性對(duì)照組相似，呈現(xiàn)為透明的藍(lán)紫色，陽(yáng)性組染色后變色不明顯。從表1可見，培養(yǎng)同樣的時(shí)間實(shí)驗(yàn)組各濃度的 OD 值之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各濃度組OD值都逐漸增高，不同濃度的實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各實(shí)驗(yàn)組均與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞毒性級(jí)別為4～5級(jí)，實(shí)驗(yàn)材料組細(xì)胞毒性級(jí)別與陰性對(duì)照組同為 0～1級(jí)，可以認(rèn)為ABM無(wú)細(xì)胞毒性。

2.2溶血試驗(yàn) 生理鹽水組和實(shí)驗(yàn)組靜置后個(gè)管內(nèi)均可見血細(xì)胞沉積，而蒸餾水組各管顏色均一，呈淡紅色，無(wú)明顯血細(xì)胞沉積。見表2。陰性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)， 與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組溶血率為1.5%，低于5%，因此判定ABM符合生物材料的溶血試驗(yàn)要求。

a：陰性對(duì)照組；b：陽(yáng)性對(duì)照組；c：實(shí)驗(yàn)組100%浸提液；d：實(shí)驗(yàn)組12.5%浸提液。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)1 d各組L929細(xì)胞的形態(tài)變化(×100)

表2 各組吸光度值和溶血率測(cè)定(n=5)

2.3陰道埋植試驗(yàn)

2.3.1大體觀察 ABM植入陰道后，傷口無(wú)紅腫、滲液等炎性反應(yīng)，植入部位未見紅腫、侵蝕和纖維包塊形成，術(shù)后12周未見ABM補(bǔ)片殘存；聚丙烯組均出現(xiàn)網(wǎng)片皺縮，有2例(40%)出現(xiàn)材料穿透陰道即侵蝕反應(yīng)。

2.3.2組織病理學(xué)觀察 術(shù)后12周，ABM膠原變性斷裂，成纖維細(xì)胞增多，周邊圍繞極少的嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，補(bǔ)片已基本降解。聚丙烯在體內(nèi)未發(fā)生降解，網(wǎng)孔周圍有較多成纖維細(xì)胞環(huán)繞，膠原纖維較紊亂，炎癥反應(yīng)呈中、重度，伴有壞死。見圖2。

A:ABM補(bǔ)片大部分降解斷裂呈紅色均質(zhì)(黑色箭頭)，與周圍宿主基質(zhì)融合。B:聚丙烯網(wǎng)片(黑色箭頭)網(wǎng)孔周圍膠原較少，有壞死(紅色箭頭)。

圖2陰道植入ABM和聚丙烯12周后的光鏡下組織學(xué)改變(HE染色×100)

3 討 論

理想的盆底修復(fù)重建替代材料應(yīng)具備無(wú)菌、持久耐用、不致癌、價(jià)廉、無(wú)抗原反應(yīng)并且能抵抗機(jī)體組織重塑[9-10],目前尚沒有可以滿足以上全部要求的替代材料。脫細(xì)胞基質(zhì)材料由于不含細(xì)胞表面受體的特異識(shí)別位點(diǎn)，不易引發(fā)受體的免疫排斥反應(yīng)，增加了組織相容性，減少了感染概率，提供了一個(gè)有利于正常的細(xì)胞生長(zhǎng),分化,血管生成的環(huán)境，能快速與宿主整合，這是組織工程移植物能長(zhǎng)期存在體內(nèi)發(fā)揮作用的關(guān)鍵。脫細(xì)胞移植物按照來(lái)源可分為同種異體和異種移植物。由于同種異體的移植材料來(lái)源有限,價(jià)格較高,且涉及倫理問(wèn)題,目前已較少作為移植材料。異種移植材料較易獲得，國(guó)外已經(jīng)商品化的異種移植物包括牛闊筋膜、牛心包、馬心包、豬小腸黏膜下組織、豬真皮、胎牛皮、豬膀胱、豬心臟瓣膜等[11-12]，在泌尿外科、耳鼻喉頭頸外科、普通外科、整形外科中已有應(yīng)用，但在婦產(chǎn)科僅有脫細(xì)胞豬真皮和豬小腸黏膜下組織作為盆底修復(fù)補(bǔ)片的少量報(bào)道。

生物相容性是生物材料研究中始終貫穿的主題,主要采用體外法和體內(nèi)植入試驗(yàn)對(duì)材料生物相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)[13]。通過(guò)相關(guān)的物理化學(xué)法對(duì)其性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，并在簡(jiǎn)化的體外模型表面上研究材料的細(xì)胞相容性即為體外法；將材料植入動(dòng)物體內(nèi)一段時(shí)間取出觀察其炎癥反應(yīng)及組織長(zhǎng)入情況，即為體內(nèi)植入試驗(yàn)，組織學(xué)檢查是其主要檢查方法。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)研究中將5種最常用的豬脫細(xì)胞基質(zhì)材料，進(jìn)行體外相關(guān)特性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABM具有最長(zhǎng)的降解周期、最強(qiáng)的抗菌性能、最高的吸水性、最好的生物力學(xué)性能，初步認(rèn)為適合于盆底特殊環(huán)境[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)參照ISO10993制定的相關(guān)方法和標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)ABM的生物相容性進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。

在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，各實(shí)驗(yàn)組、空白組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，說(shuō)明12.5%、25.0%、50.0%和100.0%的ABM浸提液對(duì)L929細(xì)胞的增殖無(wú)影響。細(xì)胞毒性與被測(cè)材料的量尤其是表面積有關(guān)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了不同濃度的浸提液比較，其結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)材料對(duì)細(xì)胞沒有毒性，符合生物材料的無(wú)毒性要求。

在溶血實(shí)驗(yàn)中,陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組靜置后各管內(nèi)均見到有血細(xì)胞的沉積，兩組OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而陽(yáng)性對(duì)照組呈淡紅色，出現(xiàn)明顯溶血，其OD值與陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。材料浸提液溶血率合格,表明本實(shí)驗(yàn)材料無(wú)溶血作用。

ABM補(bǔ)片在植入家兔陰道12周后已基本降解；顯示呈極輕、輕度炎癥反應(yīng)，ABM補(bǔ)片與宿主組織融合，纖維細(xì)胞增殖明顯，表現(xiàn)出良好的組織相容性。而聚丙烯網(wǎng)片炎癥反應(yīng)呈中、重度，伴有壞死，出現(xiàn)了臨床上常見的并發(fā)癥即侵蝕。關(guān)于聚丙烯網(wǎng)片和生物材料用于腹部疝修補(bǔ)的研究已大量報(bào)道，但植入陰道的研究相對(duì)比較缺乏。同樣的材料經(jīng)腹部手術(shù)證明是有用的，而其用于陰道手術(shù)中可能無(wú)效[15]。本實(shí)驗(yàn)將材料植入陰道更好地反映其作為盆底補(bǔ)片的生物相容性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ABM有良好的生物相容性,為其將來(lái)應(yīng)用于盆底重建替代材料方面奠定了一定基礎(chǔ)。在下一步工作中,針對(duì)盆底重建替代材料需要在體內(nèi)持久修復(fù)的要求，將ABM進(jìn)行改性處理，以提高抗酶解能力和維持力學(xué)性能的穩(wěn)定，同時(shí)延長(zhǎng)體內(nèi)植入時(shí)間，觀察材料植入體內(nèi)后生物力學(xué)性能的變化，為該材料應(yīng)用于盆底修復(fù)重建提供理論依據(jù)。

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