黃 煒,周雪琴,徐 玲,徐 勇,楊茂君

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川瀘州 646000)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病特有而嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，是終末期腎病和腎功能衰竭的主要原因之一。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是目前公認(rèn)的參與DN發(fā)病的重要致病因子，其受體拮抗劑(ARB)在臨床上也被廣泛應(yīng)用，但嚴(yán)格的血糖、血壓等控制并不能完全阻止DN的發(fā)生、發(fā)展，因此，進(jìn)一步研究DN發(fā)病機(jī)制具有重要意義。小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin related modifier,SUMO)修飾是與泛素化修飾類似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核質(zhì)運(yùn)輸與轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用，參與多條信號(hào)通路(包括TGF-β、NF-κB、MAPK信號(hào)通路)的調(diào)控。最新的研究發(fā)現(xiàn)，SUMO化修飾在多種炎癥性疾病和器官纖維化進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用，并且參與了糖尿病的發(fā)病，但SUMO蛋白與DN的關(guān)系鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。為明確SUMO蛋白與DN的關(guān)系，本研究觀察AngⅡ及氯沙坦刺激的大鼠腎系膜細(xì)胞不同亞型SUMO蛋白(SUMO1、SUMO2/3)的表達(dá)，進(jìn)一步研究DN發(fā)生機(jī)制并為其防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠腎系膜細(xì)胞(HBZY-1，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，兔抗大鼠SUMO1單克隆抗體(英國(guó)Abcam)，兔抗大鼠SUMO2/3多克隆抗體(美國(guó)Millipore)，小鼠抗大鼠GAPDH抗體(碧云天公司)，AngⅡ(美國(guó)sigma)，氯沙坦鉀(中國(guó)食品藥品檢定研究所),總蛋白抽提試劑盒(美國(guó)Chemieon)，5×Western上樣緩沖液(碧云天公司)，總RNA提取試劑盒(北京天根生化)，RT-PCR試劑盒(大連寶生物)，BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Pierce)，F(xiàn)TC2000型PCR儀，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Millipore)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HBZY-1常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的低糖(5.6 mmol/L葡萄糖)DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件37 ℃、5%CO2，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 在大鼠腎系膜細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)液中加入以下處理因素，將細(xì)胞分為5組：(1)正常對(duì)照組(NC組)，不加處理因素；(2)10-9mol/L AngⅡ 組(A1組)；(3)10-7mol/L AngⅡ 組(A2組)；(4)10-5mol/L AngⅡ組(A3組)；(5)氯沙坦預(yù)處理組(MT組)：10-5mol/L氯沙坦預(yù)處理0.5 h后再加入10-5mol/L Ang Ⅱ。分別作用24、48、72 h后，收獲細(xì)胞。

1.2.3Western blot檢測(cè)SUMO1、SUMO2/3蛋白表達(dá) 取細(xì)胞加蛋白抽提液，吹打，4 ℃離心后取上清液。BCA法測(cè)蛋白濃度,加5×Western上樣緩沖液混勻,沸水煮5 min致蛋白變性。加樣品電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加兔抗大鼠SUMO1單克隆抗體(1∶800)，兔抗大鼠SUMO2/3多克隆抗體(1∶600),小鼠抗大鼠GAPDH單克隆內(nèi)參抗體(1∶2 000)4 ℃過夜，然后加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG孵育(SUMO1、SUMO2/3)、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(內(nèi)參)，化學(xué)發(fā)光顯影，LAS-3000紫外凝膠成像系統(tǒng)成像，Quantity One軟件測(cè)蛋白條帶光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。SUMO1、SUMO2/3蛋白濃度以SUMO1、SUMO2/3與GAPDH蛋白條帶平均光密度值之比表示。

1.2.4RT-PCR法測(cè)定SUMO1、SUMO2/3 mRNA 總RNA提取試劑盒提取各組腎系膜細(xì)胞總RNA，取總RNA 4 μL為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA于PCR反應(yīng)管中擴(kuò)增，SUMO1上游引物：5′- TAT GGA CAG GAC AGC AG-3′，下游引物：5′-CCA TTC CCA GTT CTT TTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為170 bp；SUMO2/3上游引物：5′-GAC GAG AAA CCC AAG GA-3′，下游引物：5′-CTG CCG TTC ACA ATA GG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為141 bp;內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-CCT CAA GAT TGT CAG CAA T-3′，下游引物：5′-CCA TCC ACA GTC TTC TGA GT -3′ 擴(kuò)增產(chǎn)物為 141 bp。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 2 min，變性94 ℃ 30 s，退火(退火溫度為SUMO1：50.8 ℃，SUMO2/3：51.6 ℃)30 s，延伸72 ℃ 1 min;擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后上樣2%瓊脂糖凝膠電泳，采用紫外凝膠成像系統(tǒng)成像，以SUMO1、SUMO2/3的灰度值除以GAPDH的灰度值分別得到各檢測(cè)指標(biāo)相對(duì)灰度值，該相對(duì)灰度值代表各指標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1A3組作用不同時(shí)間對(duì)系膜細(xì)胞SUMO蛋白表達(dá)的影響 與NC組比較，作用24 h A3組SUMO1、SUMO2/3蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P<0.01)；隨作用時(shí)間延長(zhǎng)(48、72 h)，SUMO1和SUMO2/3蛋白表達(dá)量均逐步減弱，作用72 h后SUMO1、SUMO2/3表達(dá)量與NC組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1。

2.2不同濃度AngⅡ和氯沙坦對(duì)腎系膜細(xì)胞SUMO蛋白表達(dá)的影響 作用24 h后，A1、A2、A3組與NC組比較，SUMO1蛋白表達(dá)分別增加30%、40%和50%，SUMO2/3蛋白表達(dá)分別增加30%、70%和14%，AngⅡ呈濃度依賴性影響SUMO1蛋白表達(dá)(P<0.01)。MT組與NC組比較，SUMO1和SUMO2/3表達(dá)均增加(P<0.01)。見表2、圖2。

2.3不同濃度AngⅡ和氯沙坦對(duì)腎系膜細(xì)胞SUMO mRNA表達(dá)的影響 與NC組比較，A1、A2、A3、MT組24 h SUMO1、SUMO2/3 mRNA的表達(dá)增加(P<0.01)。見表3、圖3。

圖1 NC組與A3組不同時(shí)間點(diǎn)SUMO蛋白表達(dá)(Western blot)

圖2 各組24 h后SUMO蛋白表達(dá)(Western blot)

圖3 各組作用24 h后SUMO mRNA表達(dá)(RT-PCR)

組別SUMO1SUMO2/3NC組0.341±0.0010.112±0.011A3組24 h1.224±0.0780.440±0.032A3組48 h0.842±0.0200.184±0.006A3組72 h0.522±0.0300.145±0.032

表2 Western blot 檢測(cè)各組24 h SUMO1、SUMO2/3蛋白的表達(dá)

表3 RT-PCR檢測(cè)各組24 h SUMO1、SUMO2/3 mRNA表達(dá)

3 討 論

SUMO蛋白是廣泛存在于真核生物的高度保守的小蛋白家族(相對(duì)分子質(zhì)量約為11×103)，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核質(zhì)運(yùn)輸與轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用[1]。目前已發(fā)現(xiàn)有4個(gè)亞型:SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4， SUMO2與SUMO3氨基酸序列非常接近，常合寫成SUMO2/3。因各亞型SUMO蛋白在組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布與動(dòng)態(tài)變化不同，其功能也不盡相同。SUMO1和SUMO2/3在各種組織中均有表達(dá)，SUMO1主要修飾生理蛋白；SUMO2/3主要修飾應(yīng)激蛋白，參與滲透壓、熱休克、氧化應(yīng)激和DNA損傷等過程[2]。SUMO化參與了NF-κB、PPARγ、TGF-β和MAPK等多信號(hào)通路的調(diào)控[3-4]。

已有研究表明，SUMO化修飾參與了糖尿病發(fā)病。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),SUMO4通過與I-κB作用，負(fù)性調(diào)節(jié)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，與1型糖尿病相關(guān)[5-6]。此外，與糖尿病發(fā)病相關(guān)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)也受到SUMO化調(diào)節(jié)[7]。Woo等[8]證實(shí)AGEs可通過SUMO化修飾介導(dǎo)糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙，參與了糖尿病大血管并發(fā)癥的發(fā)生。

AngⅡ是目前公認(rèn)的參與DN發(fā)病的重要致病因子，糖尿病患者腎臟局部 AngⅡ活性增高，促進(jìn)腎小球硬化[9]。研究證實(shí)Ang Ⅱ能維持并增強(qiáng)腎臟的微炎癥反應(yīng)，激活NF-κB、TGF-β等信號(hào)，參與腎小球損傷[10]。AngⅡ與血管緊張素受體(AT受體)結(jié)合后發(fā)揮作用，目前AT受體按其作用、結(jié)構(gòu)差異等主要分為AT1和AT2受體。查閱相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合臨床實(shí)踐后發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)格的血糖、血壓控制(ACEI、ARB、CCB等)，并不能完全阻止DN的發(fā)生、發(fā)展，因此，進(jìn)一步研究AngⅡ在DN發(fā)病中的作用具有重要意義[11]。

本研究將DN發(fā)病的重要致病因子AngⅡ與SUMO化結(jié)合起來，探討AngⅡ及氯沙坦對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞SUMO表達(dá)的影響。研究結(jié)果提示，AngⅡ可刺激腎系膜細(xì)胞SUMO1、SUMO2/3表達(dá)增加，并具有一定的濃度依賴性，提示SUMO化修飾可能參與了DN發(fā)病的相關(guān)信號(hào)通路(如NF-κB)中重要信號(hào)蛋白的翻譯后修飾，激活其靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。相關(guān)研究表明：大鼠肝纖維化模型SUMO1表達(dá)增加，大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)形成過程中SUMO1表達(dá)增強(qiáng)[12]；以及SUMO1 siRNA沉默肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)SUMO1基因表達(dá)后，肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制[13]。提示SUMO作為應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，廣泛參與上述組織器官病變。本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ介導(dǎo)的SUMO表達(dá)增強(qiáng)不能被氯沙坦所逆轉(zhuǎn)，據(jù)此作者推測(cè)，氯沙坦是非肽類的選擇性AT1受體拈抗劑，競(jìng)爭(zhēng)性的拮抗Ang Ⅱ的生物學(xué)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，Ang Ⅱ可能通過作用于AT2受體或其他旁路途徑激活SUMO化相關(guān)特異性修飾酶，上調(diào)SUMO基因和蛋白的表達(dá)。研究中作者還發(fā)現(xiàn)，對(duì)AngⅡ的刺激，SUMO蛋白的表達(dá)表現(xiàn)出很強(qiáng)的時(shí)效性，各刺激組SUMO蛋白表達(dá)在24 h達(dá)在高峰后隨之遞減，作用72 h后SUMO2/3表達(dá)量與NC組相當(dāng)；并且不同亞型的SUMO蛋白反應(yīng)并不一致，如腎系膜細(xì)胞SUMO2/3在10-7mol/L Ang Ⅱ干預(yù)組表達(dá)最強(qiáng)，未發(fā)現(xiàn)10-5mol/L 的 Ang Ⅱ 進(jìn)一步促進(jìn)SUMO2/3的表達(dá)，分析原因，一方面各亞型SUMO蛋白在細(xì)胞中動(dòng)態(tài)變化和功能狀態(tài)不盡相同，SUMO2/3主要修飾應(yīng)激蛋白，其合成與降解有較強(qiáng)的時(shí)效性[14]；另一方面可能與受體數(shù)量下降和受體飽和度有關(guān)[15]。

綜上所述,Ang Ⅱ 可呈一定的濃度依賴性地刺激大鼠腎系膜細(xì)胞SUMO蛋白表達(dá)，SUMO1、SUMO2/3對(duì)Ang Ⅱ刺激的反應(yīng)不盡相同，這種改變不能被氯沙坦所阻斷，可能參與DN的發(fā)病，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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