黃成鋼劉岸唐敏

Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達及其與淋巴結轉移的關系*

黃成鋼①劉岸①唐敏①

目的：探討直腸癌組織中生長激素釋放肽（Ghrelin）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達與淋巴結轉移的關系。方法：應用免疫組織化學方法及Western blot檢測Ghrelin和MMP-9在21例無淋巴結轉移及35例有淋巴結轉移直腸癌組織中的表達水平的表達，分析Ghrelin和MMP-9與直腸癌淋巴結轉移中的關系及兩者的相關性。結果：Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的陽性表達率分別為53.57%和80.36%，明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05）；Ghrelin和MMP-9蛋白表達與腫瘤淋巴結轉移比率聯(lián)系密切，并且在直腸癌組織中的陽性表達隨著淋巴結轉移個數(shù)增加而增加（P＜0.05）；Ghrelin與MMP-9的陽性表達呈正相關（κ=0.832，P＜0.001）。結論：Ghrelin和MMP-9表達升高與直腸癌的淋巴結轉移呈正相關，聯(lián)合檢測Ghrelin和MMP-9可能對直腸癌患者淋巴結轉移及預后評估具有重要臨床價值。

直腸癌； Ghrelin； MMP-9； 淋巴轉移

作為消化系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，直腸癌患者的預后與腫瘤的轉移密切相關[1]。淋巴轉移作為直腸癌最常見的轉移方式，也是影響患者預后的重要因素，目前尚未有效的預測指標對臨床發(fā)生淋巴轉移的高危人群進行篩選，因此，尋找新的可用于臨床診斷和預后預測的分子標記，早期發(fā)現(xiàn)并給予早期干預，對提高直腸癌患者預后具有積極的意義。近年來的研究表明，生長激素釋放肽（growth hormone releasing peptide，Ghrelin）作為一種生長激素促泌劑受體的內(nèi)源性配體，可產(chǎn)生廣泛的生物學效應，在前列腺癌、胃癌和結腸癌等多種惡性腫瘤中表達升高，并與腫瘤的侵襲和轉移密切相關[2-4]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix metalloproteinases-9，MMP-9）作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族中最重要的蛋白水解酶，在調(diào)控腫瘤的侵襲和轉移的過程中發(fā)揮了重要作用[5]。本研究通過檢測Ghrelin和MMP-9在21例無淋巴結轉移直腸癌組織及35例有淋巴結轉移直腸癌組織中的表達水平，并分析其與淋巴結轉移的關系，以期更好地評價直腸癌患者發(fā)生淋巴結轉移的風險。

1 資料與方法

1.1 一般資料 56例直腸癌組織標本取自2010年1月-2013年1月在本院胃腸外科行手術切除的直腸癌患者，其中男31例，女25例，年齡24～81歲，中位年齡53歲。所有病例均術后經(jīng)病理檢查證實為直腸腺癌，患者均為首次接受腫瘤手術治療，術前均未行放化療。送檢淋巴結12～45枚，平均（15.21±3.58）枚，淋巴結轉移以術后病理檢查為準，其中無淋巴結轉移21例，有淋巴結轉移35例。術后20 min內(nèi)每份標本取材于腫瘤組織和癌旁正常黏膜組織（距腫瘤組織邊緣＞5 cm），迅速分成兩份，分別置于-80 ℃冰箱保存和10%中性甲醛中固定備用。

1.2 淋巴結轉移比率（LNR） 將腫瘤標本按淋巴結轉移比率分為：LNR0（0），LNR1（＜10%），LNR2 （10%～25%），LNR3（＞25%）。LNR=陽性淋巴結數(shù)/全部被檢淋巴結數(shù)×100%。

1.3 試劑 兔抗人Ghrelin多克隆抗體購自Sigma公司，兔抗人MMP-9多克隆抗體購自Cell Signaling公司，DAB顯色試劑盒和S-P試劑盒均購至北京中杉金橋生物技術有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所。

1.4 免疫組化檢測Ghrelin和MMP-9蛋白的表達 采用S-P法進行免疫組織化學檢測，具體步驟：將直腸癌組織標本超薄切片后常規(guī)脫蠟，0.3%的H2O2去離子水孵化20 min，經(jīng)抗原修復后分別加入Ghrelin（工作濃度1：50）和MMP-9（工作濃度為1∶150）在37 ℃下孵育3 h，PBS液沖洗3次；滴加生物素標記的二抗在室溫下孵育30 min，PBS液沖洗3次；應用DAB顯色劑顯色，經(jīng)充分沖洗、復染、脫水、透明和封片。并以PBS代替一抗作為陰性對照。在直腸癌組織中Ghrelin和MMP-9陽性細胞以細胞質(zhì)呈棕黃色顆粒為陽性。結果由2位病理科醫(yī)師獨立閱片判斷結果。低倍鏡（×100）下隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，共計數(shù)1000個細胞。結果判定標準為：（1）無陽性細胞為0分，陽性細胞數(shù)＜25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分；（2）著色強度為淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色計3分。以（1）和（2）的乘積作為評分，≤3分為陰性，＞3分為陽性。

1.5 Western blot檢測Ghrelin和MMP-9蛋白的表達 直腸癌標本從-80 ℃冰箱內(nèi)取出后，裂解細胞并分離細胞蛋白質(zhì)，用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品（20 μg/孔），常規(guī)8% SDS-PAGE電泳，半干轉膜儀轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入p-AKT一抗（1∶1000）于4 ℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG為第二抗體（1∶2500）室溫孵育1 h，ECL顯色，條帶暴光強度用Quantity One 4.6.2（BIO，RAD）軟件分析，以β-actin為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，對所有實驗數(shù)據(jù)進行組間樣本率比較用 χ2檢驗，相關性分析應用等級資料的Spearman秩相關檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達情況 如圖1所示，Ghrelin和MMP-9染色陽性細胞表現(xiàn)為胞核不著色，胞質(zhì)染成棕褐色。在56例直腸癌中，Ghrelin和MMP-9的陽性表達率分別為53.57%和80.36%，在56例癌旁正常黏膜組織中，Ghrelin和MMP-9的陽性表達率分別為12.50%和16.07%，Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達率均明顯高于癌旁正常黏膜組織中的表達（P＜0.05）。如表1所示，與淋巴結轉移陽性率低的患者相比較，淋巴結轉移率高的患者中Ghrelin和MMP-9陽性表達率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組腫瘤組織切片均以PBS（Phosphate Buffer solution）代替特異性一抗作為空白對照組，腫瘤組織鏡下均無陽性表達。

圖1 Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達（400×）

表1 Ghrelin、MMP-9蛋白在癌旁正常組織及直腸癌組織中的表達 例

圖2 Western blot檢測Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達

2.3 直腸癌中Ghrelin與MMP-9表達的相關性分析在56例直腸癌組織標本中，通過Spearman等級相關分析顯示直腸癌組織中Ghrelin的陽性表達與和MMP-9的陽性表達呈顯著正相關（κ=0.832，P＜0.001），見表2。

表2 直腸癌中Ghrelin與MMP-9表達的關系 例

3 討論

直腸癌患者淋巴結轉移是影響直腸癌患者根治術后生存率的最重要因素之一，侵襲和轉移作為惡性腫瘤的主要生物學特性，其過程是是由多種基因調(diào)控共同作用的結果。直腸癌作為消化道最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤轉移是判斷患者預后和確定治療方案的重要依據(jù)，當前僅靠單一化驗指標對直腸癌患者預后進行評估的準確性不高，因此尋求一種新的生物學標志物以期早期發(fā)現(xiàn)及阻斷直腸癌轉移，從而提高患者預后成為當前直腸癌的重點研究方向。

Ghrelin是1999年由日本Kojima等發(fā)現(xiàn)的生長激素促泌劑受體的內(nèi)源性配體，為含有28個氨基酸的活性多肽，其與受體結合后可產(chǎn)生廣泛的生物學效應，如促進生長激素分泌、減少脂肪利用、維持能量正平衡[5]。另外，Ghrelin還可促進胃酸分泌，增加胃腸蠕動和保護心臟等[6-7]。研究表明，嬰兒和胎兒有大量的Ghrelin生成細胞，但隨年齡增長Ghrelin分泌細胞不斷減少，從而提示Ghrelin與細胞增殖和分化有一定聯(lián)系[8]。2002年，Riondino等[4]首先報道Ghrelin與肝癌細胞的惡性增殖有一定聯(lián)系；在隨后的研究中，更多報道表明Ghrelin在促進多種惡性腫瘤增殖中發(fā)揮了巨大作用[2-3]；另外，在對結腸癌研究中發(fā)現(xiàn)，Ghrelin不僅與體外惡性腫瘤細胞侵襲有巨大聯(lián)系，而且與體內(nèi)腫瘤分期有一定聯(lián)系，從而表明Ghrelin與惡性腫瘤轉移關系密切[9]。在本研究中，Ghrelin在56例直腸癌組織中的陽性表達率為53.57%，明顯高于癌旁正常黏膜組織中的表達（12.50%），提示Ghrelin的表達上調(diào)與可能與直腸癌的發(fā)生相關。同時對Ghrelin的表達與直腸癌臨床病理特征進行分析可知，Ghrelin表達與直腸癌的淋巴結轉移程度相關；另外Ghrelin在直腸癌中的表達隨著淋巴結轉移增加而增加，進一步提示Ghrelin在促進直腸癌淋巴結轉移中發(fā)揮了一定的作用，與文獻[4]報道相符。

在腫瘤侵襲和轉移的過程中，金屬蛋白酶家族（MMPs）在促進腫瘤細胞侵襲、細胞外基質(zhì)降解和腫瘤細胞遠處轉移等多種生物學行為中發(fā)揮了關鍵作用，Ⅳ型膠原酶（MMP-9）作為金屬蛋白酶家族中最重要成員，MMP-9可降解細胞外基質(zhì)和基底膜，并促進腫瘤新生血管的生成，與腫瘤浸潤和轉移關系密切[10-13]。同時有研究表明，惡性腫瘤侵襲和轉移的能力與腫瘤細胞產(chǎn)生MMP-9的能力呈正相關，從而在腫瘤侵襲和轉移中扮演著重要角色[14]。在本研究中，筆者采用免疫組織化學的方法檢測MMP-9在直腸惡性腫瘤組織以及癌旁正常黏膜組織中的表達，結果表明，MMP-9在人直腸癌組織的陽性表達率高于癌旁正常黏膜組織中的表達，并且MMP-9在直腸癌淋巴結轉移率高的患者中表達進一步上調(diào)。表明MMP-9的陽性表達與直腸癌淋巴結轉移關系密切，MMP-9蛋白的表達可作為判斷直腸癌淋巴結轉移的參考標志物，有助于直腸癌患者預后的評價。筆者在對Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達進行相關性分析可知，Ghrelin的陽性表達同MMP-9的陽性表達成正相關，表明Ghrelin 和MMP-9在直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉移過程中存在協(xié)同作用，Ghrelin和MMP-9的表達程度越高，直腸癌越容易發(fā)生淋巴結轉移。

綜上所述，本研究表明Ghrelin和MMP-9的陽性表達與直腸癌淋巴結轉移相關，并且Ghrelin和MMP-9在直腸癌組織中的表達呈正相關，聯(lián)合檢測Ghrelin和MMP-9在直腸癌患者中的表達可能為腫瘤淋巴結轉移提供一定有價值的臨床參考，并為下一步探討Ghrelin和MMP-9在直腸癌中的作用機制打下基礎。

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The Correlation between Expression of Ghrelin and MMP-9 in Rectal Cancer with Lymph Node Metastasis/

HUANG Cheng-gang，LIU An，TANG Min.//Medical Innovation of China，2014，11（21）：023-026

Objective：To investigate the correlation between the Ghrelin and MMP-9 in rectal cancer tissue with lymph node metastasis.Method：A total of 21 cases of rectal cancer without lymphatic metastasis and 35 cases of rectal cancer with lymphatic metastasis were enrolled in this study.Immunohistochemical staining and western blot were performed to detect the expression of Ghrelin and MMP-9 in the tumor tissues of 56 patients.And statistical analysis technique was used to investigate the relation between their expression and the relationship between the expression of Ghrelin and MMP-9.Result：The expression of Ghrelin and MMP-9 in rectal cancer tissue was 53.57% and 80.36%，respectively，they were significantly highter than that in the adjacent mucosal tissues（P＜0.05）.There were a close correlation between the expression of Ghrelin and MMP-9 with lymph node metastasis rate（P＜0.05）.Furthermore，the positive expression of Ghrelin and MMP-9 increased with increasing lymphatic metastasis.The positive expression of Ghrelin was consistent with the positive expression of MMP-9（κ=0.832，P＜0.001）.Conclusion：Expressions of Ghrelin and MMP-9 are closely related to the degree of lymphatic metastasis of rectal cancer， and their combination may be an important indicator to evaluate the malignant degree and prognosis of the rectal cancer.

Rectal cancer； Ghrelin； MMP-9； Lymphatic metastasis

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.21.007

2014-05-28） （本文編輯：歐麗）

岳陽市科技計劃項目（【2012】5號）

①湖南省岳陽市一人民醫(yī)院 湖南 岳陽 414000

唐敏

First-author’s address：The First People’s Hospital of Yueyang，Yueyang 414000，China