汪漢成，黃艷飛，王 進(jìn)，王茂勝，商勝華，葉定勇，龍明錦

（1.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550081；2.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；3.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

煙草種子攜帶病原真菌的分離與鑒定

汪漢成1*，黃艷飛2*，王 進(jìn)3，王茂勝1，商勝華1，葉定勇1，龍明錦1

（1.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550081；2.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；3.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

采用無菌濾紙培養(yǎng)煙苗的方法對(duì)貴州主栽的 4 個(gè)烤煙品種裸種進(jìn)行了帶菌檢測(cè)，并對(duì)種子攜帶真菌進(jìn)行了分離與鑒定。結(jié)果表明，K326、貴煙 4 號(hào)、韭菜坪 2 號(hào)和南江 3 號(hào)的種子帶菌率分別為 15%、77.78%、21.67%和 61.39%。分離和鑒定發(fā)現(xiàn)種子攜帶的真菌有鏈格孢菌屬（Alternaria sp.）、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis sp.）、支頂孢屬（Acremonium sp.）、柄孢殼屬（Zopfiella sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、鐮孢菌屬（Fusarium sp.）、青霉菌屬（Penicillium sp.）、赤霉菌屬（Gibberella sp.）、芽枝孢菌屬（Cladosporium sp.）、離蠕孢屬（Bipolaris sp.）和 Stagonosporopsis cucurbitacearum 等。獲得 40 株真菌中共有22種真菌，優(yōu)勢(shì)菌群主要為鏈格孢屬、芽枝孢菌屬、鐮孢菌屬和赤霉菌屬。鏈格孢菌屬在 4個(gè)烤煙品種上均有發(fā)現(xiàn)。鐮孢菌屬主要來自于貴煙4號(hào)、韭菜坪2號(hào)和南江3號(hào)，其中南江3號(hào)種子上最多。芽枝孢菌屬僅來自貴煙4號(hào)。貴煙4號(hào)和南江3號(hào)種子上的真菌種類和數(shù)量較多。這些種子攜帶真菌的發(fā)現(xiàn)對(duì)烤煙種子的生產(chǎn)與加工具有重要的意義。

煙草種子；病原菌；分離；鑒定

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)量占全球煙草產(chǎn)量的 39.6%[1]。隨著栽培條件的變化，煙草病蟲害的危害日益嚴(yán)重，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年煙草病害造成的直接經(jīng)濟(jì)損失在 7 億元以上[2]。煙草病害的發(fā)生存在于煙草生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期，其中，由煙草種子為載體或媒介傳播、侵染新生煙株引起的煙株局部或整體發(fā)生的病害稱為煙草種傳病害[3]。煙草種子是傳播煙草病原菌最主要的途徑之一。種傳病原菌通常存在于種子表面或內(nèi)部，或以各種病殘?bào)w直接或間接混雜于種子之間。這些病原菌往往是煙草病害的初次浸染來源。據(jù)報(bào)道種子傳播引起的煙草真菌性病害有煙草炭疽病、煙草赤星病、煙草霜霉病和煙草低頭黑病等。這些病害均可導(dǎo)致苗期和大田期煙草病害的大量發(fā)生[4]，對(duì)煙草的生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。

從源頭上發(fā)現(xiàn)煙草種傳病原真菌，對(duì)其進(jìn)行分離、鑒定以及病原菌生物學(xué)習(xí)性的研究，開展種子消毒技術(shù)研究和研發(fā)新型種衣劑是提高煙草抗病能力的關(guān)鍵。然而，煙草種子的加工和處理都是建立在對(duì)煙草種傳病原菌研究的基礎(chǔ)之上。本研究以貴州省煙草良繁烤煙良種 K326、貴陽 4 號(hào)、韭坪 2號(hào)和南江3號(hào)的裸種為材料，對(duì)烤煙種子真菌性病害帶病率進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行病原菌的分離與鑒定及多樣性分析，旨在為煙草種子的加工處理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 烤煙種子和培養(yǎng)基

供試烤煙品種為 K326、貴煙 4 號(hào)、韭菜坪 2號(hào)和南江3號(hào)，所有裸種均由貴州省煙草科學(xué)研究院良繁中心提供，每品種 360 粒。種子病原真菌的分離采用 PDA 培養(yǎng)基[5]，于 2013 年 8 月在貴州省煙草科學(xué)研究院微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 種子真菌性病害帶菌率檢測(cè)

參照培養(yǎng)皿小苗法[6]，將供試烤煙種子作不消毒處理，按 6×6 方陣排列，均勻地播種于盛有用無菌水保濕濾紙的無菌平板（直徑 9 cm）中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，在每天交替光照、黑暗各 12 h下培養(yǎng) 12 d，檢查和記錄烤煙種子真菌性病害帶菌情況。

1.3 種子真菌性病害病原菌的分離

無菌條件下制備 PDA 平板。上述種子經(jīng) 12 d培養(yǎng)后形成帶病情況不同的煙苗，選取帶有不同形態(tài)、顏色和生長(zhǎng)速度菌落的病原菌煙苗，挑取少量菌絲或者孢子至于 PDA 平板，于 28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，6 d 后對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行純化，將純化的病原菌至于盛有 15%無菌甘油的菌種保存管中，于-20 ℃長(zhǎng)期保存、備用。

1.4 種子真菌性病害病原菌的鑒定

將分離到的各種病原菌轉(zhuǎn)移到 PDA 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，挑取各種病原菌的菌絲和孢子于顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。同時(shí)，利用寶生物工程（大連）有限公司的真菌基因組 DNA 提取試劑盒（TaKaRa Code: D304）提取各種病原菌的基因組 DNA。利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物 ITS1（ 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)病原菌的rDNA-ITS 區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增[7]。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 1 min，57 ℃退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，共 30 個(gè)循環(huán)；最終 72 ℃延伸10 min。采用 1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物，并送上海生工測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在 GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST 對(duì)比分析。采用分子生物學(xué)鑒定結(jié)果對(duì)各種病原菌進(jìn)行鑒定，并在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄各病原菌的基因序列信息。

2 結(jié) 果

2.1 烤煙種子真菌性病害帶菌率檢測(cè)

烤煙種子真菌性病害對(duì)種子和煙苗的危害如圖1所示。烤煙種子在被病原真菌侵染后，主要表現(xiàn)為煙苗被真菌侵染，繼而死亡。K326、貴煙 4 號(hào)、韭菜坪2號(hào)和南江3號(hào)的種子真菌性病害帶菌率各不相同，結(jié)果如表1 所示，其帶菌率分別為 15%、77.78%、21.67%和 61.39%。

2.2 烤煙種子病原真菌的鑒定

圖1 4 種烤煙種子真菌性病害帶菌率檢測(cè)Fig. 1 Fungal pathogens testing from the seeds of four tobacco cultivars

表1 不同烤煙品種真菌性病害帶菌率檢測(cè)Table 1 Fungal pathogens testing from the seeds of different tobacco cultivars

隨機(jī)挑取危害癥狀和菌落形態(tài)相同的病原真菌進(jìn)行分離和鑒定，鑒定結(jié)果如表2所示。從烤煙K326 上共分離到 3 種病原真菌，其優(yōu)勢(shì)病原菌為鏈格孢屬（Alternaria sp.），所占比例為 66.67%。從貴煙4號(hào)上共分離到9種病原真菌，其中優(yōu)勢(shì)病原菌為支孢樣支孢霉（Cladosporium cladosporioides）和鏈格孢屬，其占比例分別為 45.45%和 13.6%。從烤煙韭菜坪2號(hào)上共分離到5種病原真菌，其中優(yōu)勢(shì)病原菌為鏈格孢屬，其占比例為 60%。從南江 3號(hào)上共分離到 10 種病原真菌，其中優(yōu)勢(shì)病原菌為鐮孢菌屬（Fusarium sp.）和赤霉菌屬（Gibberella sp.）。其所占比例分別為 40%和 30%。

鑒定結(jié)果表明，煙草種子真菌性病害病原菌較多（表2），病原菌主要分布于鏈格孢菌屬（Alternaria sp.）、 擬 莖 點(diǎn) 霉 屬 （Phomopsis sp.）、 支 頂 孢 屬（Acremonium sp.）、柄孢殼屬（Zopfiella sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、鐮孢菌屬（Fusarium sp.）、青霉菌屬（Penicillium sp.）、赤霉菌屬（Gibberella sp.）、芽枝孢菌屬（Cladosporium sp.）、離蠕孢屬（Bipolaris sp.）和 Stagonosporopsis cucurbitacearum等。40 株病原真菌中，共有 22 種病原真菌（表3）；其中，芽枝孢菌屬和鏈格孢菌屬數(shù)量最多，均為 10株。芽枝孢菌屬僅分布于貴煙4號(hào)，鏈格孢菌屬在4種烤煙品種上均有發(fā)現(xiàn)。鐮孢菌屬共有6株，主要分布于貴煙4號(hào)、韭菜坪2號(hào)和南江3號(hào)，其中南江3號(hào)種子上最多（4株）。

表2 烤煙種子病原真菌鑒定Table 2 Pathogens identification from the seeds of flue-cured tobacco

表3 烤煙種子病原真菌分布情況Table 3 Pathogens distribution from the seeds of flue-cured tobacco

3 討 論

本研究以烤煙裸種為材料，采用無菌濾紙培養(yǎng)煙苗的方式來檢測(cè)煙草種子攜帶的真菌，可較好地檢測(cè)煙草種子真菌帶菌狀況；采用 PDA 培養(yǎng)基對(duì)種子病原真菌進(jìn)行分離和培養(yǎng)，可以很好的獲得煙草種子病原真菌。這種方法簡(jiǎn)便、高效、重現(xiàn)性高，可推薦作為貴州及全國(guó)煙草種子健康檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。

近年來煙草苗期和大田期病害危害日益嚴(yán)重[8-9]，對(duì)種子病原菌的研究也逐漸受到重視。譚仲夏等[10]對(duì)云南省 8 個(gè)煙草種子生產(chǎn)基地的煙草種子進(jìn)行了帶菌檢測(cè)和分離鑒定，發(fā)現(xiàn)煙草種子攜帶的病原真菌有鏈格孢、鐮孢菌、腐霉和芽枝孢菌，樣品檢出率高達(dá) 87.5%；其中，優(yōu)勢(shì)菌群為鏈格孢。華致甫等[11]發(fā)現(xiàn)煙草種子上帶有煙草赤星病菌、煙草野火病菌和鐮孢菌等，病原菌檢出率為 8%～18%；發(fā)現(xiàn)赤星病菌和野火病菌同時(shí)存在于種子表面、種皮內(nèi)部和胚乳上。本研究從貴州省烤煙良繁種子上也分離到了鏈格孢屬、芽枝孢菌屬和鐮孢菌屬優(yōu)勢(shì)病原真菌，與前人報(bào)道有共同之處[12]。進(jìn)一步說明這3種病原真菌在烤煙種子上出現(xiàn)的頻率較高，是烤煙種子生產(chǎn)上值得關(guān)注的病原菌。此外，本研究還在烤煙種子上發(fā)現(xiàn)了支頂孢屬、柄孢殼屬、曲霉屬、青霉菌屬、平臍蠕孢屬和擬莖點(diǎn)霉屬病原菌，研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了烤煙種子病原真菌的內(nèi)涵[13-14]。鏈格孢菌是引起煙草主要葉斑病害—赤星病的病原，煙草種子檢測(cè)出該菌可能與煙草種子成熟期煙草赤星病的大規(guī)模流行有關(guān)。因此，在煙草種子田間生產(chǎn)過程中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)赤星病的防治以減少煙草種子鏈格孢的攜帶量。此外，煙草種子攜帶芽枝孢菌、鐮孢菌、支頂孢等，而這些真菌并不是煙草葉部病害的病原菌。它們可能來自于其他作物，通過氣流在煙草花絮或蒴果上定殖，也可能在種子晾曬過程中傳入；對(duì)于這些病原真菌的來源開展研究，可以從源頭上減少煙草種子的帶菌量。

4 結(jié) 論

本研究檢測(cè)的 K326、貴煙 4 號(hào)、韭菜坪 2 號(hào)和南江 3 號(hào)的種子帶菌率分別為 15%、77.78%、21.67%和 61.39 %。分離和鑒定發(fā)現(xiàn)種子攜帶的真菌 有 鏈 格 孢 菌 屬 （ Alternaria sp.）、 擬 莖 點(diǎn) 霉 屬（Phomopsis sp.）、支頂孢屬（Acremonium sp.）、柄孢殼屬（Zopfiella sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、鐮孢菌屬（Fusarium sp.）、青霉菌屬（Penicillium sp.）、 赤 霉 菌 屬 （Gibberella sp.）、 芽 枝 孢 菌 屬（Cladosporium sp.）、離蠕孢屬（Bipolaris sp.）和Stagonosporopsis cucurbitacearum 等。獲得 40 株真菌中共有 22 種真菌，優(yōu)勢(shì)菌群主要為鏈格孢屬、芽枝孢菌屬、鐮孢菌屬和赤霉菌屬。鏈格孢菌屬在4個(gè)烤煙品種上均有發(fā)現(xiàn)。鐮孢菌屬主要來自于貴煙4號(hào)、韭菜坪2號(hào)和南江3號(hào)，其中南江3號(hào)種子上最多。芽枝孢菌屬僅來自貴煙4號(hào)。貴煙4號(hào)和南江3號(hào)種子上的真菌種類和數(shù)量較多。這些真菌均會(huì)侵染種子或者煙苗，在烤煙種子包衣前很有必要對(duì)種子進(jìn)行消毒處理，以提高烤煙生產(chǎn)用種的種子質(zhì)量。

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Fungi Isolation and Identification on Tobacco Seeds

WANG Hancheng1*, HUANG Yanfei2*, WANG Jin3, WANG Maosheng1, SHANG Shenghua1, YE Dingyong1, LONG Mingjin1
(1. Guizhou Academy of Tobacco Sciences, Guiyang 550081, China; 2. College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China; 3. College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China)

Fungi levels in four tobacco cultivars in Guizhou province were tested on tobacco seedlings that incubated on sterile filter paper. The fungi were isolated and identified. Results showed that fungi levels in K326, Guiyan 4, Jiucaiping 2, and Nanjiang 3 were 15%, 77.78%, 21.67% and 61.39%, respectively. The fungi in those four cultivars included Alternaria sp., Phomopsis sp., Acremonium sp., Zopfiella sp., Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Gibberella sp., Cladosporium sp., Bipolaris sp., and Stagonosporopsis cucurbitacearum. Forty isolates were isolated all together, in between about 22 different fungi. However, Alternaria sp., Cladosporium sp., Fusarium sp. and Gibberella sp. were the dominant fungi. Alternaria sp. were found on all four cultivars; Fusarium sp. were found on Guiyan 4, Jiucaiping 2 and Nanjiang 3, and was dominant on cultivar Nanjing 3. Cladosporium sp. was only found on cultivar Guiyan 4. The number of fungi and number of species were the highest in cultivar Guiyan 4 and Nanjiang 3. Those findings provide important information for tobacco seed production and process.

tobacco seeds; isolation; identification; pathogen

S572.08

1007-5119（2014）05-0084-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.05.016

國(guó)家自然科學(xué)基金（31360448）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金{黔科合 J 字[2011]2337 號(hào)}；中國(guó)煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目（201305，201336，201436）

汪漢成，男，博士，副研究員，主要從事煙草植物保護(hù)和微生物學(xué)研究。E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com。*同等貢獻(xiàn)作者

2014-04-29

2014-07-22