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        HPLC法同時(shí)測(cè)定旱芹中木犀草素和旱芹素的含量

        2014-03-14 08:39:50李敏孫蓮孟磊
        食品研究與開發(fā) 2014年10期
        關(guān)鍵詞:草素木犀醋酸

        李敏,孫蓮,孟磊

        (新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,新疆烏魯木齊830011)

        HPLC法同時(shí)測(cè)定旱芹中木犀草素和旱芹素的含量

        李敏,孫蓮*,孟磊

        (新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,新疆烏魯木齊830011)

        建立HPLC法同時(shí)測(cè)定旱芹中木犀草素和旱芹素含量的方法。采用C18(150mm×4.6mm,5μm)柱,流動(dòng)相為乙腈∶0.01mol/L醋酸銨(pH=4.8)=40∶60,等強(qiáng)度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm,柱溫25℃,流速1.0m L/min。木犀草素和旱芹素的質(zhì)量濃度分別在0.93μg/mL~4.94μg/mL(r=0.9991)及1.03μg/mL~5.06μg/mL(r=0.999 4)范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,平均加樣回收率依次為99.7%(RSD為2.4%),99.0%(RSD為1.8%)。

        旱芹;木犀草素;旱芹素;高效液相色譜法

        旱芹(Apium graveolens L.)是傘形科旱芹屬的草本植物。我國古代已有研究,具有“補(bǔ)血、祛風(fēng)、健脾利濕”的作用,自古有“藥芹”之譽(yù)。旱芹為藥食兩用植物[1-2],被稱為“廚房中藥材”。旱芹含有豐富的黃酮類化合物,黃酮是旱芹中主要的活性成分,旱芹中的黃酮類成分主要為木犀草素和旱芹素等,旱芹黃酮具有抗氧化,鎮(zhèn)靜,止痛,抗肝炎,降壓,降脂作用以及抗腫瘤作用[3-5]。由此可見,旱芹是一種具有很高藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的植物,研究旱芹黃酮具有重要的意義,本文建立了HPLC法同時(shí)檢測(cè)旱芹中的木犀草素和旱芹素含量[6-7]的方法,為旱芹的質(zhì)量控制和開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

        1 儀器與試劑

        1.1 儀器

        Agilentl200高效液相色譜儀(包括G1322A脫氣裝置、G1312B二元高壓泵、G1367C高性能自動(dòng)進(jìn)樣器、GI316B柱溫箱、G1315C二極管陣列檢測(cè)器):美國,安捷倫科技有限公司,XS105型十萬分之一電子天平:德國,梅特勒一托利多儀器有限公司。

        1.2 供試品與試劑

        乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純,水為純凈水:娃哈哈飲用水;木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品(22803):上海晶純實(shí)業(yè)有限公司;旱芹素標(biāo)準(zhǔn)品(A0113):成都曼斯特生物科技有限公司。

        新鮮自然成熟的旱芹地上部分,采自烏魯木齊市郊區(qū)菜園,經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室帕麗達(dá)·阿不力孜教授鑒定為傘形科旱芹屬植物旱芹(Apium graveolens L.),分離莖和葉,用適量水洗凈,干燥,粉碎。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        色譜柱:C18柱(150mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相:乙腈:0.01mol/L醋酸銨(調(diào)pH為4.8)=40∶60,檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm,柱溫:25℃,流速為:1.00mL/min,進(jìn)樣量為:10μL,在上述色譜條件下,木犀草素和旱芹素色譜峰保留時(shí)間合適,峰形良好,供試品中木犀草素和旱芹素與其他組分分離良好,分離度>1.5,木犀草素和旱芹素的質(zhì)量濃度分別在0.93μg/mL~4.94μg/mL(r= 0.999 1)及1.03μg/mL~5.06μg/mL(r=0.999 4)范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,色譜圖見圖1。

        圖1 對(duì)照品(A)及供試品(B)色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of refercnce substances(A)and sample(B)

        2.2 對(duì)照品溶液的制備

        精密稱取木犀草素對(duì)照品4.0mg,旱芹素對(duì)照品5.8mg置于25mL的容量瓶中,甲醇溶解,并稀釋至刻度,搖勻,即得0.16mg/mL木犀草素及0.23mg/mL旱芹素的對(duì)照品溶液。

        2.3 供試品溶液的制備

        精密稱取過60目篩的旱芹莖粉末1.000 0 g置于125mL錐形瓶中,加80%甲醇溶液30mL,于40℃時(shí)超聲提取30min,過濾,濾渣再用30mL 80%甲醇,同法提取2次,合并濾液和洗滌液,減壓濃縮,殘?jiān)蒙倭考状既芙?,轉(zhuǎn)移到10mL的容量瓶中,用甲醇定溶至刻線,搖勻,0.22μm微孔濾膜濾過,即得供試品溶液。

        2.4 線性關(guān)系考察

        分別精密吸取木犀草素對(duì)照品溶液60、70、80、240、400、600、700μL和旱芹素對(duì)照品溶液10、25、35、55、75、96、115μL于5mL容量瓶中,用80%甲醇稀釋至刻線,配成不同濃度的混合標(biāo)液,在上述色譜條件下進(jìn)樣10μL,測(cè)定峰面積。以木犀草素和旱芹素進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程及線性范圍見表1。

        表1 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table1 The regression equation,correlation coefficient and linear range

        2.5 精密度試驗(yàn)

        精密吸取對(duì)照品溶液5μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積。結(jié)果木犀草素、旱芹素峰面積的RSD分別為2.9%、1.7%,表明精密度良好。

        2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取供試品溶液,依上述色譜條件,在0、1、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣5μL,測(cè)定峰面積。結(jié)果木犀草素、旱芹素含量的RSD分別為1.8%、2.6%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

        精密稱取旱芹莖供試品5份,按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液,依上述色譜條件,進(jìn)樣10μL,測(cè)定峰面積。結(jié)果木犀草素、旱芹素含量的RSD分別為1.3%、1.7%,表明重復(fù)性良好。

        2.8 回收率試驗(yàn)

        取“2.7”項(xiàng)下已測(cè)知木犀草素、旱芹素含量的旱芹莖供試品共18份,精密稱定,分別置125mL錐形瓶中,再分別以低、中、高3個(gè)濃度精密加入木犀草素、旱芹素的對(duì)照品溶液適量,按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試溶液,依上述色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積。結(jié)果木犀草素、旱芹素的平均回收率分別為99.5%(RSD=1.1%)、100.1%(RSD=1.3%),結(jié)果見表2。

        2.9 供試品含量測(cè)定

        取3批旱芹莖和葉的供試品,分別按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各3份,依上述色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,以外標(biāo)法計(jì)算含量,結(jié)果見表3。

        表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table2 Recovery test results

        表3 供試品的含量測(cè)定結(jié)果Table3 Results of content determination of samples

        3 結(jié)論

        建立了同時(shí)測(cè)定旱芹中木犀草素和旱芹素含量的方法。該方法的線性系數(shù)均在0.999以上,平均加樣回收率為99.7%和99.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%和1.8%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本方法行之有效,穩(wěn)定可靠,適用于測(cè)定旱芹中木犀草素和旱芹素的含量。

        4 討論

        4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

        取木犀草素和旱芹素對(duì)照品溶液在200 nm~ 450 nm區(qū)間掃描。結(jié)果表明,木犀草素在355 nm處有最大吸收,而旱芹素在270 nm處有最大吸收,故選擇330 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng),在此波長(zhǎng)下的兩種組分都有較好的吸收,木犀草素和旱芹素在此波長(zhǎng)處可獲得較好的分離。

        4.2 流動(dòng)相的選擇

        分別考察了甲醇-0.01mol/L醋酸銨,乙腈-0.01mol/L醋酸銨,甲醇-乙腈-0.01mol/L醋酸銨溶液等為流動(dòng)相,發(fā)現(xiàn)乙腈-0.01mol/L醋酸銨為流動(dòng)相時(shí),分離較好,木犀草素和旱芹素在8min內(nèi)完全分離。分別試驗(yàn)了乙腈∶0.01mol/L醋酸銨(pH=4.8)=90∶10、乙腈∶0.01mol/L醋酸銨(pH=4.8)=80∶20、乙腈∶0.01mol/L醋酸銨(pH=4.8)=70∶30、乙腈∶0.01mol/L醋酸銨(pH= 4.8)=60∶40、乙腈∶0.01mol/L醋酸銨(pH=4.8)=50∶50、乙腈∶0.01 mol/L醋酸銨(pH=4.8)=40∶60、乙腈∶0.01mol/L醋酸銨(pH=4.8)=30∶70為流動(dòng)相,結(jié)果表明乙腈∶0.01mol/L醋酸銨(pH=4.8)=40∶60為流動(dòng)相時(shí),木犀草素和旱芹素峰形較好,并且分離較好。同時(shí)還試驗(yàn)了0.01mol/L醋酸銨的pH為3.5、3.8、4.0、4.5、4.8、5.0、5.5時(shí)的分離效果,發(fā)現(xiàn)緩沖鹽的pH為4.8時(shí),旱芹素和木犀草素分離效果較好,基線較平穩(wěn)。故本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈∶0.01mol/L醋酸銨(pH=4.8)=40∶60為流動(dòng)相,等梯度洗脫,流速為1.0mL/min。

        [1]宋小俊,王怡婷.旱芹藥用功能研究概述[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008, 36(15):360-361

        [2]沈明高,金陽,李薇雅.旱芹的化學(xué)成分及其藥理作用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(4):1474-1475,1489

        [3]劉全德,唐世榮,宋慧,等.超聲波-微波協(xié)同萃取旱芹黃酮的工藝研究[J].食品與機(jī)械,2010,26(5):134-136

        [4]何書美,劉敬蘭.旱芹中黃酮類物質(zhì)的提取和測(cè)定[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2008,25(8):85-87

        [5]龐玲玲,李若然,周林福,等.旱芹素對(duì)哮喘小鼠轉(zhuǎn)錄激活蛋白3及Th2型細(xì)胞因子抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,30(4):383-387

        [6]王克勤,羅軍武,陳靜萍,等.高效液相色譜法測(cè)定旱芹中旱芹素含量[J].食品與機(jī)械,2009,25(2):74-77

        [7]王克勤,羅軍武,陳靜萍,等.旱芹提取物中旱芹素的HPLC與HPTLC定量分析研究[J].食品科學(xué),2008,29(4):291-295

        Determination of Luteolin and Apigenin in Apium graveolen L.by HPLC

        LI Min,SUN Lian*,MENG Lei
        (College of Pharmacy,Xinjiang Medical University,Urumqi830011,Xinjiang,China)

        To establish a method for simultaneous determination of Luteolin and Apigenin in Apium graveolen L. by HPLC.The sepration was performed on an C18column with acetonitrile0.01mol/L ammonium acetate(pH=4.8)= 60∶40 as a mobile phase at a flow rate of 1.0mL/min.The detection wavelength was 330 nm at25℃.There were good linear relationships between the mass concentrations and the peak areas of luteolin and apigenin in the ranges of 0.93μg/mL-4.94μg/mL(r=0.9991)and 1.03μg/mL-5.06μg/mL(r=0.999 4)respectively.The average recoveries were99.7%with RSD 2.4%and 99.0%with RSD 1.8%respectively.The method was quick,simple and repeatable for the determination of Luteolin and Apigenin in Apium graveolen L.

        Apium graveolen L.;luteolin;apigenin;HPLC

        10.3969/j.issn.1005-6521.2014.010.029

        2013-03-08

        李敏(1983—),女(漢),講師,碩士,研究方向:天然產(chǎn)物活性成分研究與利用。

        *通信作者:孫蓮(1961—),女(漢),教授,碩士,研究方向:藥物分析。

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