李國慧，劉瑞花，李貴霞，張麗霞

(1.河北省兒童醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050031;2.河北省老年病醫(yī)院藥劑科，河北 石家莊 050011；3.河北省兒童醫(yī)院成人科，河北 石家莊 050031)

骨肉瘤，又稱成骨肉瘤，是青少年最常見的惡性成骨性腫瘤之一，該瘤惡性程度高，預(yù)后極差。以大劑量化療為主的綜合治療效果并不理想，且不良反應(yīng)大?？鄥A作為藥用植物在我國據(jù)文字記載已有2 000多年的歷史，目前在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，有關(guān)苦參堿抗腫瘤作用也受到了人們的廣泛關(guān)注。本研究初步觀察了苦參堿對骨肉瘤MG63細胞生長、增殖的影響，旨在為苦參堿抗腫瘤作用的臨床應(yīng)用提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)：人骨肉瘤MG63細胞株由河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院實驗中心保存，提供使用。MG63細胞生長在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基37℃飽和濕度5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞進入對數(shù)生長期后用于實驗。

1.2 倒置相差顯微鏡下觀察：將MG63細胞接種于放有蓋玻片的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)生長期，換用含有不同濃度苦參堿的新鮮培養(yǎng)基，定時鏡下觀察并照相。

1.3 四甲基偶氮唑藍實驗：取對數(shù)生長期A21-2細胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細胞濃度為1×104/mL，每孔200μL接種于96孔板，培養(yǎng)24h后吸去培養(yǎng)液，加入含藥的培養(yǎng)液，分別設(shè)對照組(不含藥培養(yǎng)基)和不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L)苦參堿組，每組設(shè)10個復(fù)孔。分別培養(yǎng)48、72h，培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入20μL四甲基偶氮唑藍(5g/L)，37℃繼續(xù)孵育4h(藥物繼續(xù)作用)，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，在振蕩器上振蕩15min，用全自動酶標儀(測定波長492nm，參考波長630nm)測定各孔吸光度(A)值計算細胞生長抑制率并計算IC50值以及相關(guān)系數(shù)(r)。細胞生長抑制率(%)=(A對照-A實驗)÷A對照×100%

1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測定caspase-3mRNA的表達

1.4.1 細胞總RNA的提?。簩瓷鲜龇纸M干預(yù)過的細胞，吸去培養(yǎng)液，每瓶加入TRIZOL 1mL，冰上振蕩裂解15min，將瓶內(nèi)液體移入離心管內(nèi)，分別加入0.2mL氯仿，顛倒混勻，4℃，12 000r/min離心15min，小心吸取上層水相移入另一離心管內(nèi)，加入異丙醇0.5mL混勻，靜置30min,4℃，12 000r/min離心10min，棄上清，沉淀用75%乙醇洗兩遍，干燥后用30μL DEPC水溶解，取5μL，用紫外分光光度計測其RNA濃度。

1.4.2 cDNA的合成：取總RNA5μg，在70℃變性10min后，加入1μL 10 mmol/LdNTP，4μL 3U RNA酶抑制劑，1μL 50ng/μL 隨機引物，2μL(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶，4μL(5×AMV)緩沖液，用超純水補足到20 μL。反應(yīng)條件為25℃ 10min，42℃ 1h，95℃ 5min，得到cDNA。

1.4.3 聚合酶鏈反應(yīng)：反應(yīng)總體積為20μL，包括4μL cDNA，25mmol/L MgCl21.5μL，0.5U Taq酶1μL，10μmol/L引物各0.7μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，10×buffer 0.8μL，用超純水補足到20μL。聚合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)條件，94℃預(yù)變性5min，94℃30s，56℃退火30s，72℃延伸45s,30個循環(huán)，72℃復(fù)性5min。引物由北京奧科生物技術(shù)公司設(shè)計合成。Caspase-3引物序列上游，5′-TTCAGAGGGGATC-GTTGTAGAAGTC-3′；下游，5′-CAAGCTTGTCGGCATAC-TGTTTCAG -3′(265bp)；β-actin上游，5′-GACAGGCA-GAAGGAGATTACTG-3′；下游，5′-GCTGATCCACAT-CTGCTGGAA-3′(142bp)。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰氨凝膠電泳，溴化乙錠顯色，Bio-profif 凝膠圖像分析系統(tǒng)進行攝像分析。通過caspase-3/β-actine灰度比值作相對定量。

2 結(jié) 果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察結(jié)果：鏡下可見對照組細胞貼壁生長，呈梭形或多角形，核圓形，胞漿透亮，細胞增殖狀態(tài)良好(圖1A)。0.6g/L的苦參堿干預(yù)MG63細胞72h后見部分細胞脫落，懸浮于培養(yǎng)基中，在貼壁生長的細胞中有少數(shù)可見膜破裂呈壞死狀。且高濃度組比低濃度組效果更明顯(圖1B)。

圖1苦參堿作用MG63細胞72h后倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果

A.對照組細胞( ×20);B.0.6g/L苦參堿作用72h后( ×20)

Figure 1 The morphological changes of MG63 cells treated with matrine for 72h

A.Control cells( ×20);B.Cells treated with 0.6g/L matrine ( ×20)

2.2 四甲基偶氮唑藍實驗結(jié)果：各濃度苦參堿對MG63細胞的生長均具有抑制作用，且隨著苦參堿濃度的增高，作用時間的延長，抑制率也隨著增加，當應(yīng)用1g/L苦參堿處理MG63細胞72h后，其增殖抑制率達到71.16%，顯示出較強的增殖抑制作用?？鄥A作用48h的IC50為1.019g/L?？鄥A作用72h的IC50為0.701g/L，且藥物濃度與抑制率之間呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系(r=0.979 7,P<0.01)。不同濃度處理組間的比較表明不同濃度苦參堿對細胞的生長抑制作用差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。并且相同濃度苦參堿，隨著時間的延長，抑制作用明顯增強，具有良好的時效關(guān)系(表1)。

Matrine concentrations (g/L)48hMTT-A valueInhibitory rate (%) 72hMTT-A valueInhibitory rate (%) 0(control)0.225±0.0220.290±0.0230.20.196±0.010?8.990.256±0.009?11.890.40.182±0.010?15.270.236±0.018?18.640.60.155±0.006?27.700.170±0.009?41.350.80.137±0.008?36.270.101±0.011?65.131.00.104±0.004?51.770.084±0.013?71.16

*P<0.01vscontrol group byANOVA

2.3 Caspase-3 mRNA表達情況：由反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的聚丙烯酰氨凝膠電泳圖可以觀察到，經(jīng)0.4、0.6、0.8g/L的苦參堿處理的MG63細胞72h后，與對照組相比caspase-3的條帶明顯變亮，由MG63細胞得caspase-3mRNA/β-actin比值分別為0.519±0.105、0.754±0.173、0.973±0.165，與對照組0.131±0.107比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。

圖2 苦參堿作用MG63細胞72h后caspase-3 mRNA 的表達分析

標記條帶：標記DNA；條帶1：對照組；條帶2：苦參堿濃度為0.4g/L；條帶3：苦參堿濃度為0.6g/L；條帶4：苦參堿濃度為0.8g/L

Figure 2 Analysis of the caspase-3 mRNA expression in MG63 cells treated with matrine for 72 hours

Lane marker: DNA marker;Lane 1:control cells; Lane 2:0.4g/L matrine;Lane 3:0.6g/L matrine;Lane 4:0.8 g/L matrine

3 討 論

目前癌癥已成為嚴重危害人類生命和健康的常見病、多發(fā)病。癌癥之所以難以治愈是由于癌細胞不受機體控制而無限增殖，同時癌細胞具有侵襲性，能夠破壞鄰近的組織和器官，從而使癌癥難以徹底治愈?？鄥A是從中藥苦參的干燥根中提取的一類活性物質(zhì)，具有明顯的抗炎、抗病毒、抗心律失常等功效[1-2]。近年來其抗腫瘤的作用引起了人們的廣泛關(guān)注[3-4]。本研究將苦參堿作用于 MG63細胞株，觀察藥物作用后癌細胞細胞形態(tài)學(xué)的變化，觀察癌細胞受抑制情況以及caspase-3表達情況，旨在為苦參堿在臨床治療腫瘤過程中提供理論依據(jù)。腫瘤細胞的顯著特點之一就是生長失控，無限增殖。直接殺死腫瘤細胞是諸多抗腫瘤藥物的主要作用。本研究結(jié)果顯示，苦參堿作于MG63細胞后，倒置相差顯微鏡下觀察到，與對照組相比，用藥組的細胞生長明顯被抑制，胞漿內(nèi)顆粒增多增粗，細胞貼壁能力減弱，部分細胞收縮、變圓而懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)。

有研究[5-10]發(fā)現(xiàn)苦參堿可呈劑量依賴性的抑制癌細胞的增殖。本研究結(jié)果顯示，苦參堿能有效抑制MG63細胞的生長，當作用一定時間時，隨著藥物濃度的增加，苦參堿對MG63細胞的生長抑制率逐漸上升；當藥物濃度一定時，適當延長作用時間，抑制率也明顯上升。這表明苦參堿對MG63細胞的抑制作用具有明顯的時間和劑量依賴性。

Caspase-3又稱半胱氨酸蛋白酶32或Yama/Apopain，是caspase家族的重要成員，caspase-3的表達下調(diào)與惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移和病理分級密切相關(guān)，說明caspase-3在惡性腫瘤表達下調(diào)導(dǎo)致癌細胞凋亡失控，進而參與惡性腫瘤的發(fā)生與演進過程，因此研究caspase-3在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用，以探尋如何在分子水平上促進腫瘤細胞的凋亡，已日益成為臨床腫瘤康復(fù)治療過程中提高患者生存率和改善患者生活質(zhì)量的全新研究方向。本研究應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)觀察到經(jīng)不同濃度苦參堿處理的MG63細胞中caspase-3mRNA 表達不同，其表達的高低與苦參堿的藥物濃度呈正相關(guān)。表明苦參堿可使caspase-3基因的mRNA表達水平上調(diào)，這可能是苦參堿促進腫瘤細胞凋亡的作用機制之一，即通過使caspase-3表達上調(diào)而實現(xiàn)。

[1] 李素梅,蔣永興,常靚．氧化苦參堿的研究進展[J].中國保健營養(yǎng),2012,22(6):1701-1702.

[2] 閆桂珍,郭景生.苦參堿滴丸抗心律失常作用的實驗研究[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2004,25(3):142-143.

[3] ZHANG JQ,LI YM,LIU T,et al.Antitumor effect of matrine in human hepatoma G2 cells by inducing apoptosis and autophagy[J].World J Gastmenterol,2010,16(34):4281-4290.

[4] QIN XG,HUA Z,SHUANG W,et al.Effects of matrine on HepG2 cell proliferation and expression of tumor relevant proteins in vitro[J].Pharm Biol,2010,48(3):275-281.

[5] DAI ZJ,GAO J,JI ZZ,et al.Matrine induces apoptosis in gastric carcinoma cells via alteration of Fas/FasL and activation of Caspase-3[J].J Ethnopharmacol,2009,123(1):91-96.

[6] LIU T,SONG Y,CHEN H,et al.Matrine inhibits proliferation and induces apoptosis of pancreatic cancer cells in vitro and vivo[J].Biol Pharm Bull,2010,33(10):1740-1745.

[7] HAN Y,ZHANG S,WU J,et al.Matrine induces apoptosis of human multiple myeloma cells via activation of the mitochondrial pathway[J].Leuk Lymphoma，2010,51(7):1337-1346.

[8] LIANG CZ,ZHANG JK,SHI Z,et al.Matrine induces caspase-dependent epoptosis in human osteosarcoma cells in vitro and invivo through the upregulation of Bax and Fal/FasL and downregulation of Bcl-2[J].Cancer Chemother Pharmacol,2012,69(2):217-331.

[9] ZHAO B,LI B,BAI S,et al.Effects of matrine on proliferation and apoptosis of cultured retinoblastoma cells[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2012,250(6):897-905.

[10] ZHANG S,QI J,SUN L,et al.Matrine induces programmed cell death and trgulates expression of relevant genes based on PCR array analysis in C6 glioma cells[J].Mol Biol Rep,2009,36(4):791-799.