鄭新華吳和平孫銀銀苑廣超

腦缺血再灌注Na+-K+-ATPase損傷作用的實(shí)驗(yàn)性治療初探*

鄭新華①吳和平②孫銀銀①苑廣超①

目的：探討尼莫地平和東莨菪堿治療腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)理。方法：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈和椎動(dòng)脈復(fù)制腦完全性缺血模型。60只家兔均分成六組，假手術(shù)組﹑腦缺血組﹑腦缺血再灌注組﹑腦低溫治療組﹑東莨菪堿治療組﹑尼莫地平治療組。采集腦和血液標(biāo)本測量Na+-K+-ATPase﹑超氧化物歧化酶（SOD）﹑丙二醛（MDA）活性。結(jié)果：缺血再灌注組腦組織SOD和Na+-K+-ATPase活性降低﹑MDA含量升高；相反，治療組SOD和Na+-K+-ATPase活性升高，MDA含量降低。結(jié)論：東莨菪堿和尼莫地平具有保護(hù)缺血再灌注組腦組織Na+-K+-ATPase活性的作用，其機(jī)理可能與它們抑制自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，減少脂質(zhì)過氧化物的生成有關(guān)。

腦缺血再灌注； Na+-K+-ATP酶； 東莨菪堿； 尼莫地平

腦組織Na+-K+-ATPase對缺血再灌注損傷十分敏感[1]，這在腦復(fù)蘇領(lǐng)域中一直未引起足夠的重視。目前認(rèn)為再灌注大量生成的自由基介導(dǎo)的膜脂質(zhì)過氧化是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制[2-4]。本研究試圖從這一角度，以頭部低溫為陽性對照，以東莨菪堿（莨菪堿類藥），尼莫地平（Ca2+拮抗劑）為代表藥，探討它們對腦缺血再灌注Na+-K+-ATPase損傷的作用及作用機(jī)理，并進(jìn)一步為莨菪堿類藥和Ca2+拮抗劑防治腦缺血再灌注損傷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 大耳白兔（湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）60只，體重1.4～1.8 kg，雌雄不拘，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，飲水不限，應(yīng)用25%烏拉坦靜脈麻醉，機(jī)械通氣；監(jiān)測血?dú)?，維持PaCO2于4.32～5.47 kPa。動(dòng)物均分為六組。假手術(shù)組：只做相應(yīng)的操作，未夾閉血管，不造成缺血再灌注過程；腦缺血組：假手術(shù)組+腦缺血30 min；腦缺血再灌注組：腦缺血組+再灌注90 min；腦低溫治療組：腦缺血再灌注+腦低溫，即再灌注開始由蠕動(dòng)泵5 mL/（kg·min）輸入經(jīng)“體外血液降溫系統(tǒng)”冷卻的血液，再灌注期間（90 min）保持腦溫在（26±0.25）℃；東莨菪堿治療組：腦缺血再灌注組+東莨菪堿，即再灌注開始靜脈注射東莨菪堿（廣州僑光制藥廠）0.2 mg/kg；尼莫地平治療組：腦缺血再灌注組+尼莫地平，即再灌注開始靜脈注射尼莫地平（西德 Bayer Leverkusen 公司生產(chǎn)）60 μg/kg。

各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間保持直腸溫度在37～38 ℃。再灌注期間平均動(dòng)脈壓維持平均在（11.24±0.25）kPa（與實(shí)驗(yàn)前的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05）。

1.2 腦完全性缺血模型復(fù)制 四血管式（夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈和椎動(dòng)脈）+低血壓法[平均動(dòng)脈壓降至（5.45±0.21）kPa][5-6]。

1.3 選擇性腦低溫法 按照文獻(xiàn)[7]建立自左股動(dòng)脈﹑左頸總動(dòng)脈近心端經(jīng)蠕動(dòng)泵﹑冰水槽至左頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端的“體外血液降溫系統(tǒng)”。在枕葉顱骨鉆一小孔，置入針樣熱敏探頭監(jiān)測腦溫。

1.4 標(biāo)本采集及測量方法 除腦缺血組外（缺血30 min末），其余組在再灌注90 min末（假手術(shù)組相應(yīng)于再灌注90 min末的時(shí)間），在動(dòng)物存活下取適量枕頂皮層，放入液氮中保存，在冰浴下制成腦勻漿并參照文獻(xiàn)[8]測量Na+-K+-ATPase活性，超氧化物歧化酶（SOD）﹑丙二醛（MDA），測量方法同文獻(xiàn)[5-6]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（±s）表示，組間均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織Na+-K+-ATPase活性 以腦缺血再灌注組最低，腦低溫治療組﹑東莨菪堿治療組和尼莫地平治療組的Na+-K+-ATPase活性顯著高于腦缺血再灌注組（P分別＜0.05和＜0.01），與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腦低溫治療組﹑東莨菪堿組和尼莫地平治療組三組間的Na+-K+-ATPase活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；見表1。

表1 各組腦組織Na+-K+-ATPase活性、SOD活性、MDA含量比較（±s）

表1 各組腦組織Na+-K+-ATPase活性、SOD活性、MDA含量比較（±s）

*與假手術(shù)組比較，P＜0.01；△與腦缺血組比較，P＜0.01；與腦缺血再灌注組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

組別 Na+-K+-ATPase活性［（μmolPi/（h·mg）］ SOD活性（U/mg） MDA（nmol/mg）假手術(shù)組（n=10） 18.60±2.68 1.9935±0.2206 3.23±0.68腦缺血組（n=10） 14.17±2.14 1.8241±0.1516 3.72±0.43腦缺血再灌注組（n=10） 9.80±3.90*△ 0.9715±0.1943*△ 4.67±0.62*△腦低溫治療組（n=10） 14.36±2.97# 1.9538±0.1735▲ 3.38±0.35▲東莨菪堿治療組（n=10） 16.17±3.58▲ 2.0146±0.1372▲ 3.61±0.47▲尼莫地平治療組（n=10） 14.75±1.18# 1.9679±0.1641▲ 3.57±0.84▲

2.2 腦組織SOD活性 3個(gè)治療組（腦低溫治療組﹑東莨菪堿治療組﹑尼莫地平治療組）的SOD活性接近假手術(shù)組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高于腦缺血組和腦缺血再灌注組，但與腦缺血組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與腦缺血再灌注組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 腦組織MDA含量 以腦缺血再灌注組最高，腦缺血組次之，但腦缺血組與除腦缺血再灌注組外的其他組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腦缺血再灌注組與除腦缺血組外的其他組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；腦低溫治療組﹑東莨菪堿治療組﹑尼莫地平治療組的MDA含量變化與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

大量研究證實(shí)氧自由基是缺血再灌注損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)和啟動(dòng)因子，其介導(dǎo)的膜脂質(zhì)過氧化而引起生物膜結(jié)構(gòu)破壞﹑功能受損等改變被認(rèn)為是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制。自由基的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，壽命僅幾微秒至百分之幾秒，直接檢測目前較困難。因此本實(shí)驗(yàn)與眾多文獻(xiàn)一樣用測量SOD活性和MDA含量間接反映機(jī)體清除自由基能力和脂質(zhì)過氧化程度。

低溫[9]﹑莨菪堿類藥[5-6]﹑Ca2+拮抗劑均有保護(hù)SOD活性[10]﹑抑制自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化等作用而減輕或改善腦缺血再灌注損傷。研究表明低溫還有保護(hù)缺血再灌注腦組織Na+-K+-ATPasee的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)表明東莨菪堿和尼莫地平同低溫一樣也有保護(hù)再灌注腦組織Na+-K+-ATPase活性的作用。

腦Na+-K+-ATPase是位于腦細(xì)胞膜上的一種大分子蛋白質(zhì)，其對缺血再灌注損傷十分敏感的機(jī)理還未有深入研究的報(bào)道。研究表明磷脂腺絲氨酸和磷脂腺肌醇以及脂肪酸的不飽和程度和鏈長均影響著Na+-K+-ATPase活性[11-12]。自由基攻擊的靶位是不飽和脂肪酸，而人體內(nèi)的不飽和脂肪酸主要位于生物膜中。顯然，Na+-K+-ATPase的這些特性易遭受自由基損害。Sugawara[13]認(rèn)為再灌注Na+-K+-ATPase損傷的機(jī)理可能主要與自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化物直接抑制酶活性有關(guān)。再灌注自由基大量生成的機(jī)制主要與黃嘌呤氧化酶有關(guān)；Marro[14]研究證實(shí)，黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇能保護(hù)缺氧乳豬腦細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase活性。Pierr[15]的研究表明，自由基清除劑EGP761能預(yù)防腦缺血鼠Na+-K+-ATPase損傷。也有觀點(diǎn)認(rèn)為NO也是一種自由基[16]，它還可以生成毒性更強(qiáng)的OH-和NO2

-，引起蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化反應(yīng)且使脂質(zhì)過氧化程度加重，進(jìn)一步破壞DNA，還可使一些重要酶失活，細(xì)胞能量代謝障礙，還參與細(xì)胞凋亡的信號通路，加重腦缺血再灌注損傷。但Groenendaal[17]給予NO合成酶抑制劑NNLA未能保護(hù)乳豬腦細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，SOD活性降低，MDA含量升高，Na+-K+-ATPase活性下降，反之，SOD活性升高，MDA含量下降，Na+-K+-ATPase活性升高。提示缺血再灌注腦組織Na+-K+-ATPase損傷與自由基和脂質(zhì)過氧化含量緊密相關(guān)；東莨菪堿和尼莫地平保護(hù)缺血再灌注組腦組織Na+-K+-ATPase活性作用的機(jī)理可能與它們保護(hù)了缺血再灌注時(shí)內(nèi)源性SOD活性，提高機(jī)體清除自由基的能力，抑制自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用，減少脂質(zhì)過氧化物的生成有關(guān)。

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醫(yī)學(xué)論文表與圖的寫作要求

一﹑制表的基本要求

1.重點(diǎn)突出，簡單明了，主謂分明，層次清楚。

2.結(jié)構(gòu)完整，有自明性，表的內(nèi)容不要與文字﹑插圖重復(fù)。

3.表中的量﹑單位﹑符號﹑縮略語等須與正文一致。

二﹑圖應(yīng)具有自明性，即只看圖﹑圖題和圖例，不閱讀正文，就可理解圖意；內(nèi)容不要與文字﹑表格重復(fù)；類型應(yīng)與資料性質(zhì)匹配。

1.線條圖要求線條均勻﹑主輔線分明，并使數(shù)軸上刻度值的標(biāo)法符合數(shù)學(xué)原則。

2.照片圖要求有良好的清晰度和對比度，層次分明，反差適中，沒有雜亂的背景。

3.圖高度與寬度的比例一般掌握在5∶7左右。

4.圖中的量﹑單位﹑符號﹑縮略語等須與正文一致。

The Experiment Therapy of Na+-K+-ATPase Activity Inhibiting in Encephalon Ischemia-reperfusion Injury/

ZHENG Xin-hua， WU He-ping， SUN Yin-yin， et al.// Medical Innovation of China，2014，11（19）：014-016

Objective： To discuss the effect and mechanics of scopolamine and nimodipine in treating encephalon ischemia-reperfusion injury. Method： The ischemia-reperfusion model was made by occluding the rabbits bilateral common carotid artery and vertebral artery. 30 rabbits were divided into normal group， ischemia group， ischemiareperfusion group， hypothermia treatment group， scopolamine treatment group and nimodipine treatment group. Blood samples were collected for assay of superoxide dismutase（SOD）， malonic dialdehyde（MDA） and Na+-K+-ATPase. Result： The SOD and Na+-K+-ATPase activities reduced and the MDA level increased significantly in ischemiareperfusion group. Otherwise， the SOD and Na+-K+-ATPase activities increased and the MDA level decreased in treatment group. Conclusion： Like the low temperature treatment， scopolamine and nimodipine can effectively protect the Na+-K+-ATPase activity in encephalon ischemia-reperfusion injury by inhibiting the reperfusion injury resulting from lipid peroxidation led by free radical.

Encephalon ischemia reperfusion； Na+-K+-ATPase； Scopolamine； Nimodipine

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.19.005

2014-05-22） （本文編輯：郎威）

湖北省衛(wèi)生廳科研課題（W211704）

①武漢市中醫(yī)院 湖北 武漢 430014

①湖北省中醫(yī)院

鄭新華

First-author’s address： Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430014，China