徐 青，付子毅，吳小莉，皇甫玉爽，凌 靜

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市婦幼保健院婦科，南京 210004）

hsa-miR-197在子宮肌瘤中的表達及生物信息學(xué)特征分析

徐 青，付子毅，吳小莉，皇甫玉爽，凌 靜

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市婦幼保健院婦科，南京 210004）

應(yīng)用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)檢測子宮肌瘤組織中的hsa-miR-197表達水平，并與配對正常子宮肌細胞對比。通過miRbase、UCSC、NCBI等在線數(shù)據(jù)庫獲取并分析hsa-miR-197序列保守性及其基因組特征。選擇miRanda、MirTarget2及TargetScan三個在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa-miR-197的靶基因并取交集以便后續(xù)分析。通過基因本體（GO）功能注釋、GO富集分析和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析初步闡明，hsamiR-197靶基因參與調(diào)控的細胞功能與信號通路。hsa-miR-197的功能較廣泛，參與腫瘤發(fā)生的多種生物學(xué)過程，提示hsa-miR-197可能與子宮肌瘤的發(fā)病機制密切相關(guān)。

子宮肌瘤；hsa-miR-197；生物信息學(xué)；靶基因

1 前言

子宮肌瘤是育齡期女性最常見的盆腔腫瘤，45歲女性的發(fā)病率超過60%，可導(dǎo)致月經(jīng)過多、盆腔痛、習(xí)慣性流產(chǎn)及不孕等一系列臨床癥狀，嚴(yán)重威脅女性的身心健康[1]。最近研究表明，miRNAs對子宮肌瘤細胞的增殖、凋亡及受類固醇激素的調(diào)控在子宮肌瘤的發(fā)病機制中起到重要的作用[2]，研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-197在多種腫瘤中（肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌及子宮肌瘤等）表達具有差異[3～7]。本研究擬探討hsa-miR-197在子宮肌瘤組織中的表達，并通過在線數(shù)據(jù)庫、運用生物信息學(xué)軟件對hsa-miR-197生物學(xué)特征以及功能進行預(yù)測分析，從而為深入研究hsa-miR-197在子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的分子機制提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 臨床樣本

12例子宮肌瘤組織和配對正常子宮肌組織標(biāo)本來源于南京市婦幼保健院行子宮肌瘤剔除術(shù)的患者，年齡為36～49歲，所有患者均無內(nèi)科合并癥，月經(jīng)規(guī)律，術(shù)前3個月內(nèi)未服用激素類藥物。采取標(biāo)本均得到患者的同意，并簽署了知情同意書，術(shù)后病理學(xué)診斷為子宮肌瘤。

2.2 試劑及儀器

miRNeasy總核糖核酸（RNA）抽提試劑盒（德國QIAGEN公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaqMan MicroRNA Assay，ABI7500熒光定量PCR儀及ABI 7900 PCR儀（美國ABI公司）。

2.3 組織處理及RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄

樣品在離體后應(yīng)迅速冷凍在液氮中，把組織剪切成約100 mg大小，使液氮迅速滲透到組織內(nèi)部而防止組織內(nèi)部的RNA降解；將剪切好的樣品放入勻漿管中加入1 mL TRIzol后用組織勻漿器將其在冰上勻漿3～5 min，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，而后進行RNA抽提。RNA操作中所需玻璃和金屬器材均經(jīng)過180℃處理2 h；塑料器材均用含0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水中浸泡過夜后高壓滅菌；溶液均用DEPC水配制或配制好后用DEPC處理過夜后高壓滅菌，令RNA酶滅活。將離心管中的液體在室溫下放置5 min；加入200 μL氯仿，蓋緊管口，劇烈振蕩 15 s后，靜置2 min；12000×g 4℃離心15 min；吸取上清液于另一Eppendorf離心管中；加入0.5 mL異丙醇，顛倒數(shù)次，室溫靜置 10 min；12000×g 4℃離心10 min，可見白色膠樣RNA沉淀；輕輕吸去上清液，加入1 mL 75%乙醇，混勻，漩渦振蕩洗滌，7500×g 4℃離心5 min；吸去上清液后干燥沉淀5～10 min；用50 μL DEPC處理的水重新溶解RNA，必要時55～60℃水浴10 min助于溶解；保存于-80℃。分光光度儀定量選擇OD260/OD280比值為1.9～2.1的RNA樣品，濃度均在1.5μg/μL以上。

按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit說明書加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需試劑，miR-197引物、總RNA等進行反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄條件：16℃、30 min；42℃、30 min；85℃、4 min。將逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 Real-time PCR

使用探針法檢測miR-197的表達量。使用逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA作為模版進行qPCR擴增，根據(jù)Premix ExTaq試劑盒說明加入premix、TaqMan MicroRNA Assays提供的miR-197探針進行反應(yīng)。Real-time PCR條件為：95℃、2 min→（95℃、15 s→60℃、30 s）循環(huán)40次，采集熒光值。每個樣本均設(shè)復(fù)孔，并以U6作為內(nèi)參，獨立實驗重復(fù)3次。計算平均CT值，以目的和內(nèi)參基因為對照，應(yīng)用相對定量法（ΔΔCT法）進行半定量分析，用2-ΔΔCT值表示目的基因相對對照的miRNA表達量。

2.5 生物信息學(xué)分析

筆者通過Pubmed(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）查閱已發(fā)表的hsa-miR-197相關(guān)文獻支持的已有功能。利用miRBase（http：//www.mirbase.org/）、UCSC（http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）數(shù)據(jù)庫查找hsa-miR-197堿基序列、染色體定位、物種保守性等基本信息。選擇miRanda（http：//www.microrna.org/）、MirTarget2（http：//mirdb.org/miRDB/）及 TargetScan（http：//www.targetscan.org/）三個主流數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa-miR-197的靶基因，取三者的交集并結(jié)合已經(jīng)證實的靶標(biāo)基（FUS1），采用BINGO進行GO注釋的顯著性分析[8]。選擇所有蛋白編碼基因作為背景基因，使用超幾何分布計算P值，以P＜0.05為顯著性閾值，得到基因集合相對于背景具有統(tǒng)計意義的注釋，即基因集合在GO類別上的分布信息；選擇DAVID數(shù)據(jù)庫對hsa-miR-197預(yù)測的靶基因集合進行基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）的Pathway分析，通過FisherExactTest計算P值，以P＜0.05為顯著性閾值得到基因集合相對背景具有統(tǒng)計意義的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及疾病通路。

3 結(jié)果

3.1 子宮肌瘤組織中miR-197的表達特點

為了確定miR-197在子宮肌瘤組織中的表達異常，筆者從臨床采集了12對不同子宮肌瘤患者的新鮮子宮肌瘤和其配對正常的子宮肌組織，通過Realtime PCR的方法檢測子宮肌瘤組織和子宮肌層組織中miR-197的表達量。如圖1所示，與正常子宮肌組織相比，miR-197的表達在子宮肌瘤組織中顯著降低（P<0.05）。在12例病人中，除去8號病人，其他11例病人子宮肌瘤組織中的miR-197表達水平均明顯低于其在相應(yīng)子宮肌組織中的表達。上述實驗結(jié)果表明，miR-197在子宮肌瘤組織中表達下調(diào)，為進一步研究其生物學(xué)功能提供了初步依據(jù)。

圖1 miR-197在12例子宮肌瘤組織及配對正常子宮肌組織中的相對表達Fig.1 Relative miR-197 expression in the uterine leiomyomas tissues and paired normal myometrium

3.2 hsa-miR-197基因分析

參考NCBI數(shù)據(jù)庫筆者發(fā)現(xiàn)hsa-miR-197基因位于人類1號染色體p13.3區(qū)域，基因大小為75 bp，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pre-miR-197的序列5′-GGCUGUGCCGGGUAGAGAGGGCAGUGGGAGGUAAG AGCUCUUCACCCUUCACCACCUUCUCCACCCAGCAUGGCC-3′；miRbase數(shù)據(jù)庫顯示hsa-miR-197基因的序列在多個物種間高度保守，其轉(zhuǎn)錄成熟體為hsa-miR-197-5p（5′-cggguagaga gggcagugggagg-3′）及 hsa-miR-197-3p（5′-uucaccaccuucuccacccagc-3′）兩個剪切體，其中以hsa-miR-197-3p為主。通過UCSC在線數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-197在人、恒河猴、狗、大象等物種間高度保守（見圖2），提示hsa-miR-197具有潛在的重要生物學(xué)功能。

圖2 hsa-miR-197保守性分析Fig.2 Conservative analysis of hsa-miR-197

3.3 hsa-miR-197的靶基因預(yù)測

MiRanda、MirTarget2及TargetScan預(yù)測的靶基因數(shù)量分別為7644個、320個和217個，3種數(shù)據(jù)庫的計算結(jié)果取交集，合并已證實的靶標(biāo)，共獲得75個候選靶基因，部分預(yù)測的hsa-miR-197靶基因見表1。

表1 部分預(yù)測hsa-miR-197靶基因Table 1 Predicted target-genes of hsa-miR-197

3.4 hsa-miR-197預(yù)測靶基因集合的GO注釋分析及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析

功能富集分析預(yù)測的結(jié)果顯示，hsa-miR-197調(diào)控的靶基因功能分別富集在DNA依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、突觸傳遞的調(diào)控、胚胎器官發(fā)育、細胞周期正調(diào)控、細胞間通信等生物學(xué)過程，部分結(jié)果見圖3。

圖3 hsa-miR-197預(yù)測靶基因集合的GO分析結(jié)果Fig.3 GO analysis of candidate target genes of hsa-miR-197

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析的結(jié)果顯示，hsa-miR-197靶基因顯著富集于涉及JAK-STAT、Toll樣受體、Caspase凋亡等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，部分結(jié)果見圖4。

圖4 hsa-miR-197靶基因集合的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析結(jié)果Fig.4 Pathway analysis of candidate target genes of hsa-miR-197

4 討論

近年來子宮肌瘤的發(fā)病率迅速上升，雖然治療技術(shù)有了很大的提高，但仍是育齡期婦女子宮切除的重要原因之一。最新研究表明子，子宮是內(nèi)分泌器官[9]，過早切除會嚴(yán)重影響女性健康。迄今為止，人類對子宮肌瘤仍然沒有令人滿意的治療手段，預(yù)防并控制其發(fā)展是子宮肌瘤治療中尚待解決的問題。

進入新世紀(jì)后，腫瘤的基因治療越來越受到人們的關(guān)注，也取得了不小的突破與成就。目前的基因治療絕大部分是針對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中單個目標(biāo)基因進行干預(yù)，以達到治療的效果。但是腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多條信號通路與多種關(guān)鍵基因蛋白變化，因此針對單獨靶點的基因治療有其明顯的缺陷[10]。MicroRNA(miRNA)的發(fā)現(xiàn)與深入研究有望填補這一空白。miRNA是一類長度約22 nt的具有在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的內(nèi)源性非編碼小分子RNA[11]，通過與mRNA 3′端非翻譯區(qū)完全或不完全互補配對從而剪切mRNA或抑制翻譯起始。miRNAs通過調(diào)節(jié)靶向基因的表達廣泛參與幾乎所有的細胞過程中，因此，miRNAs在發(fā)育、細胞增殖、凋亡和分化等重要生物學(xué)過程中起重要作用，并與腫瘤發(fā)生等人類的疾病密切相關(guān)[12]。

已有報道發(fā)現(xiàn)，多個miRNAs在子宮平滑肌瘤及子宮肌層組織平滑肌細胞中表達并發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[13]。miR-197是miRNA大家族中的一員，近年來的研究表明，miR-197參與多種生物學(xué)過程并與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3～7]。相關(guān)功能研究表明：miR-197在腫瘤發(fā)生中細胞增殖與凋亡異常[14]、基因多態(tài)性及信號傳遞通路[15]中都有所表現(xiàn)，但miR-197與子宮肌瘤發(fā)病機制之間的相關(guān)研究未見報道。已有文獻證實，miRNAs在子宮肌瘤細胞與正常子宮肌細胞之間存在差異表達（包括miR-197）[7]，因此，筆者將miR-197作為進一步研究的對象。本文應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測組織miR-197的表達，結(jié)果證實子宮肌瘤組織和相應(yīng)子宮肌層組織具有顯著性差異，并呈現(xiàn)出在子宮肌瘤組織中低表達的特征。結(jié)果提示，相對于正常子宮肌層組織，miR-197的表達在子宮肌瘤組織中顯著降低，很可能與子宮肌瘤的發(fā)生相關(guān)。這一結(jié)果與國外報道的子宮肌瘤細胞中miR-197的表達較子宮肌細胞顯著下調(diào)一致[16]，均提示miR-197很可能參與子宮肌瘤的發(fā)生，但具體機制還不清楚，因此首先借助生物信息學(xué)在線分析工具對hsa-miR-197進行分析，預(yù)測其可能的靶基因，正確認(rèn)識靶基因之間的相互作用，對具體研究其生物學(xué)功能有著重要意義。

鑒于目前實驗鑒定成功的靶向關(guān)系遠不能滿足在系統(tǒng)水平上實現(xiàn)對miRNAs相關(guān)功能的全面認(rèn)識。生物信息學(xué)的迅速發(fā)展為全面研究miRNAs相關(guān)功能提供了方便。利用數(shù)據(jù)庫技術(shù)，將miRNAs、靶基因和各種生物信息數(shù)據(jù)庫連接起來，可以對單個或多個miRNAs的相關(guān)功能進行直接預(yù)測，為實驗研究提供方向性指導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-197序列在人、恒河猴、狗、大象等物種間具有高度保守性，提示其可能具有較為強大的生物學(xué)功能。mi-RNAs既可作為抑癌基因，下調(diào)原癌基因的活性；也可作為致癌基因，下調(diào)抑癌基因的活性，從而形成錯綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。最近一些研究證實，hsa-miR-197在多種腫瘤中表達異常，具有抑癌基因的作用，與腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡密切相關(guān)，對于腫瘤的診斷、治療和預(yù)后具有十分重大的意義[18]。miRanda、MirTarget2及TargetScan是目前信息學(xué)中應(yīng)用較廣泛的miRNA靶基因預(yù)測在線軟件。miRanda是最早的一種預(yù)測算法，有較好的檢出率，預(yù)測的靶基因數(shù)量較多，但假陽性率也較高，在miRanda數(shù)據(jù)庫中檢索出hsamiR-197有7644個靶基因。TargetScan和PicTar作為第二代預(yù)測算法，其預(yù)測靶基因的數(shù)量相對減少，但同時也增加了預(yù)測的精確度，降低了假陽性率[19]，利用這兩個數(shù)據(jù)庫預(yù)測的hsa-miR-197靶基因分別為320個和217個。雖然這3種不同的軟件預(yù)測的結(jié)果不一樣，但同時采用這3種預(yù)測算法進行預(yù)測，然后取其交集部分（共75個靶基因），就能提高預(yù)測結(jié)果的可靠性，減少假陽性率。

本研究針對3個數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果，采用生物信息學(xué)方法對基因集合進行GO功能注釋、GO富集分析和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，多層次、多角度對hsa-miR-197的預(yù)測基因進行描述。筆者發(fā)現(xiàn)hsamiR-197靶基因的功能主要涉及DNA依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、突觸傳遞的調(diào)控、細胞周期正調(diào)控、細胞間通信等與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的生物學(xué)過程（P＜0.05）；同時，信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)miR-197的靶基因主要參與JAK-STAT、Toll樣受體、Caspase凋亡等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（P＜0.05）。由于這些生物學(xué)功能涉及腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個階段，據(jù)此可推測hsa-miR-197在多種腫瘤中表達異常，并通過調(diào)控其靶基因的表達引起多種生物學(xué)特征的變化。本次研究對hsamiR-197在子宮肌瘤組織中的表達進行了驗證，并采用生物信息學(xué)方法對hsa-miR-197生物學(xué)特性及其功能進行初步分析，擬通過實驗進一步認(rèn)識子宮肌瘤的發(fā)病機制和對mi-RNAs異常表達識別，從而定義其自身的功能和治療靶點，為子宮肌瘤的診斷、治療和預(yù)后提供理論依據(jù)和試驗基礎(chǔ)。

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The expression mode of hsa-miR-197 in uterine leiomyomas tissue and related bioinformatics analysis

Xu Qing，F(xiàn)u Ziyi，Wu Xiaoli，Huangfu Yushuang，Ling Jing

(Gynecology of Affiliated Nanjing Maternal and Child Health Hospital，Nanjing Medical University，Nanjing 210004，China)

We performed Real-time PCR to detect the hsa-miR-197 expression levels in uterine leiomyomas tissues and paired normal myometrium separately；online databases including miRbase，UCSC，NCBI are employed to analysis the sequence conservation and genetic characteristics of hsa-miR-197；miRNA databases such as miRanda，MirTarget2 and TargetScan are chosen to predict hsa-miR-197 target genes；meanwhile，the intersection genes of these miRNA databases are chosen，and GO and Pathway analysis of these genes are carried out to explore the potential role of hsa-miR-197 playing in regulating the uterine leiomyomas occurrence and development.hsa-miR-197 functions in broad ground and participates in uterine leiomyomas multiple biology progress，which indicates that hsa-miR-197 could regulate uterine leiomyomas occurrence and development.

uterine leiomyomas；hsa-miR-197；bioinformatics analysis；target genes

R169

A

1009-1742（2014）05-0099-06

2014-04-03

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（81202042）；南京市衛(wèi)生局科技發(fā)展項目（QRX11212）

徐 青，1979年出生，女，浙江上虞市人，主治醫(yī)師，研究方向為婦科腫瘤；E-mail：xq079054@163.com