（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定 071000）

EMS處理對(duì)大白菜種子萌發(fā)及主要生化指標(biāo)的影響

盧 銀 劉夢(mèng)洋 王彥華 羅雙霞 軒淑欣 趙建軍 申書(shū)興*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定 071000）

為了探討大白菜誘變育種的新方式，研究了不同濃度EMS處理對(duì)大白菜種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)及其主要生化指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：在0～1.0%濃度范圍內(nèi)，隨著EMS濃度的增加，大白菜種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率逐漸降低，幼苗根尖和葉緣褐化程度逐漸加劇，成活率下降，種子浸出液電導(dǎo)率以及種子和幼苗的MDA含量均逐漸增加；EMS對(duì)種子及幼苗SOD、POD活性影響表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制。適宜大白菜種子誘變處理的EMS濃度范圍為0.4%～0.6%。

大白菜；EMS；發(fā)芽率；SOD；POD；MDA

基因突變是種質(zhì)創(chuàng)新的根本途徑，但在自然條件下基因突變率很低，人工誘變可使基因突變率提高千倍以上，甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）是當(dāng)今應(yīng)用效果最好的化學(xué)誘變劑之一，已成功地應(yīng)用于多種作物的誘變育種（Wang et al.，2008；Stephenson et al.，2012），并在作物突變體庫(kù)的構(gòu)建和反向遺傳學(xué)等基礎(chǔ)研究中發(fā)揮了重要作用。Feiz等（2009a，2009b）利用EMS誘變技術(shù)創(chuàng)建了2 500株普通軟質(zhì)小麥突變體庫(kù)，并推算每隔12 kb有1個(gè)突變發(fā)生，是目前報(bào)道突變頻率最高的突變體庫(kù)。Slade等（2005）應(yīng)用定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)（targeting induced local lesions in genomes，TILLING）從EMS誘變種子后代1 920個(gè)糯性基因小麥突變個(gè)體中篩到246個(gè)等位基因，獲得了豐富的遺傳信息和有價(jià)值的突變個(gè)體。在蕓薹屬作物中，EMS誘變研究主要針對(duì)甘藍(lán)型油菜，關(guān)于大白菜〔Brasscia campestris L. ssp. pekinensis （Lour）Olsson〕EMS誘變研究尚無(wú)報(bào)道（和江明 等，2004；Ferrie et al.，2008；原小燕 等，2010）。本試驗(yàn)采用不同濃度的EMS處理大白菜種子，對(duì)種子萌發(fā)特性、電導(dǎo)率及種子和子葉幼苗超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量變化進(jìn)行研究，確定適宜大白菜種子誘變處理的適宜EMS濃度，明確EMS處理對(duì)細(xì)胞膜透性及保護(hù)酶系統(tǒng)的影響，為大白菜誘變育種及反向遺傳學(xué)等基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2012年8月在河北省蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。以市售大白菜當(dāng)年商品種津育80及河北省蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室低溫保存5 a的自交系種子99-2為試材。津育80為青麻葉直筒形，中晚熟，生育期80～85 d，球頂呈花心形；99-2為筒形，球頂部合抱，中晚熟，生育期80 d左右。

1.2 方法

1.2.1 EMS處理對(duì)種子萌發(fā)的影響 挑選飽滿的種子，每個(gè)品種分成6組，每組50粒，25 ℃清水浸種2 h后分別用濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的EMS浸種，80 r·min-1高速震蕩處理4 h，自來(lái)水沖洗2 h后轉(zhuǎn)至鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中25 ℃/20 ℃（晝/夜）條件下催芽。以清水處理為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。3 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，7 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，10 d后統(tǒng)計(jì)成活率，并記錄子葉幼苗發(fā)育情況。

1.2.2 EMS處理對(duì)種子浸出液電導(dǎo)率的影響 挑選飽滿的種子，每個(gè)品種分成6組，每組50粒，稱質(zhì)量；EMS處理同1.2.1，自來(lái)水沖洗2 h后，于10 mL蒸餾水中浸泡0.5 h，采用上海雷磁儀器廠生產(chǎn)的DDS-307型電導(dǎo)儀測(cè)定浸出液電導(dǎo)率；以靜置0.5 h的蒸餾水為空白對(duì)照（毛培勝 等，2008）。

1.2.3 EMS處理對(duì)種子和幼苗POD、SOD活性及MDA含量的影響 分別用濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的EMS高速震蕩處理4 h、水洗2 h的種子及催芽7 d后的幼苗各1 g，進(jìn)行SOD、POD活性及MDA含量測(cè)定。以清水處理為對(duì)照，3次重復(fù)。SOD活性測(cè)定采用Fridorich NBT光還原法（李合生，1999），POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法（張志良，2000），MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法（趙世杰 等，1991）。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS處理對(duì)大白菜種子萌發(fā)的影響

由表1可知， EMS處理對(duì)大白菜種子萌發(fā)及幼苗發(fā)育產(chǎn)生了抑制作用。隨著EMS濃度增加，津育80和99-2的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及成活率大體呈逐漸下降的趨勢(shì)，幼苗的損傷程度也逐漸加劇，表現(xiàn)為幼苗弱小、根尖及子葉葉緣褐化、腐爛發(fā)黑等現(xiàn)象。

表1 不同濃度EMS處理對(duì)大白菜種子萌發(fā)及幼苗發(fā)育特性的影響

通常以半致死劑量為適宜處理濃度，本試驗(yàn)中，當(dāng)EMS濃度為0.4%時(shí)，99-2種子催芽10 d后的成活率為52%，且發(fā)育成植株后能正常生長(zhǎng)；當(dāng)EMS濃度為0.6%和0.8%時(shí)，津育80的成活率接近50%，但EMS濃度為0.8%的處理后期幼苗逐漸死亡，最終發(fā)育成植株的僅為27%。所以處理99-2和津育80種子的適宜EMS濃度為0.4%～0.6%。

2.2 EMS處理對(duì)大白菜種子電導(dǎo)率的影響

由圖1可知，當(dāng)EMS濃度低于0.2%時(shí)，兩種大白菜種子浸出液的電導(dǎo)率均在5 mS·cm-1·g-1以下；當(dāng)EMS濃度大于0.2%時(shí)，兩種大白菜種子浸出液的電導(dǎo)率均隨EMS濃度增加而增大；當(dāng)EMS濃度為1.0%時(shí)，津育80和99-2種子浸出液的電導(dǎo)率分別增至108.65、268.73 mS·cm-1·g-1。說(shuō)明隨著EMS濃度增加，更多的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，細(xì)胞質(zhì)膜受害嚴(yán)重，且99-2較津育80受害程度更大。

圖1 不同濃度EMS處理對(duì)大白菜種子電導(dǎo)率的影響

2.3 EMS處理對(duì)大白菜種子及幼苗SOD、POD活性的影響

如圖2、3所示，隨著EMS濃度增加，大白菜種子及幼苗SOD、POD活性均呈先增加后降低的趨勢(shì)，且種子的SOD、POD活性整體高于幼苗。當(dāng)EMS濃度為0.6%時(shí)，津育80種子及幼苗SOD、POD活性均達(dá)到最大值；而99-2種子及幼苗SOD、POD活性達(dá)到最大值時(shí)的EMS濃度為0.4%。

不同濃度EMS處理的99-2種子SOD活性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于津育80，POD活性除0.6% 濃度處理外亦均高于津育80。99-2幼苗的SOD、POD活性基本上低于津育80，EMS濃度低于0.6%時(shí)，二者差異不大；而當(dāng)EMS濃度高于0.6%時(shí)，99-2幼苗SOD、POD活性迅速下降，與津育80的差異增大。

圖2 不同濃度EMS處理對(duì)大白菜種子及幼苗SOD活性的影響

圖3 不同濃度EMS處理對(duì)大白菜種子及幼苗POD活性的影響

2.4 EMS處理對(duì)大白菜種子及幼苗MDA含量的的影響

由圖4、5可知，隨著EMS濃度的增加，兩種大白菜種子和幼苗的MDA含量都呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，種子的MDA含量均明顯高于幼苗；且不同濃度EMS處理99-2種子和幼苗的MDA含量均高于津育80。當(dāng)EMS濃度為0.4%～0.6%時(shí)，99-2種子和幼苗的MDA含量迅速增加，此后增加趨勢(shì)趨于緩和；津育80種子MDA含量在EMS濃度為0.6%～0.8%時(shí)迅速增加，而幼苗MDA含量的增加趨勢(shì)整體比較緩和。表明EMS處理對(duì)大白菜種子的作用效應(yīng)高于幼苗，而且老化的、生理狀態(tài)弱的種子受毒害時(shí)其體內(nèi)有害物質(zhì)的積累也高于新的、生理狀態(tài)好的種子。

圖4 不同濃度EMS處理對(duì)大白菜種子MDA含量的影響

圖5 不同濃度EMS處理對(duì)大白菜幼苗MDA含量的影響

3 結(jié)論與討論

高秀華等（2006）用0.2%～0.5%的EMS處理鹽芥種子，發(fā)現(xiàn)隨著EMS濃度增加M1發(fā)芽率逐漸降低，黃化嵌合苗數(shù)量也隨之增加。王幼平等（1999）用EMS處理海甘藍(lán)種子，發(fā)現(xiàn)低劑量EMS促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，而較高劑量EMS則降低種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率。本試驗(yàn)結(jié)果表明，EMS處理對(duì)兩種大白菜種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育都產(chǎn)生了抑制作用，且隨著EMS濃度增加抑制作用增強(qiáng)。兩份供試材料的生態(tài)型相似，但對(duì)EMS濃度反應(yīng)存在差異，津育80對(duì)EMS的耐受性明顯優(yōu)于99-2，這可能與兩份材料的生理狀態(tài)有關(guān)，99-2種子存放了5 a，老化程度加劇，種子活力減弱。

突變劑引發(fā)遺傳物質(zhì)的變化，存在一個(gè)吸收能量的閥值，一般多以植株存活一半的劑量即半致死劑量（LD50）作為引變敏感性指標(biāo)（王長(zhǎng)里 等，2008）。本試驗(yàn)中，99-2和津育80種子發(fā)芽成活率約為50%時(shí)的EMS濃度分別為0.4%和0.6%，同時(shí)，0.4%和0.6%也分別是這兩份材料種子SOD、POD活性達(dá)到最大、MDA含量迅速增加時(shí)的EMS濃度。因此，在大白菜種子誘變育種中，EMS處理的適宜濃度為0.4%～0.6%，處理時(shí)間為4 h。

EMS處理誘發(fā)了細(xì)胞內(nèi)一系列生理生化反應(yīng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基等有害大分子，而SOD、POD作為保護(hù)性酶可有效地清除這些有害物質(zhì)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，種子的POD、SOD活性及MDA含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于幼苗。一方面可能是由于EMS的作用在種子發(fā)育成幼苗的過(guò)程中逐漸被機(jī)體代謝掉，導(dǎo)致其對(duì)幼苗的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及種子；另一方面，幼苗較種子單位質(zhì)量?jī)?nèi)含有更多的蛋白質(zhì)和糖等物質(zhì)，質(zhì)量基數(shù)較大。Smith和Berjak（1995）認(rèn)為，種子生命力的喪失與自由基的傷害有關(guān)，陳種子在保存過(guò)程中必然會(huì)產(chǎn)生并積累一定量的自由基，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物即為MDA。本試驗(yàn)中，相同濃度EMS處理，99-2無(wú)論是種子還是幼苗的MDA含量均高于津育80，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及成活率均低于津育80，褐化情況也更為嚴(yán)重。此外，99-2種子的SOD、POD活性基本上高于津育80，可能就是由于機(jī)體為應(yīng)對(duì)高濃度自由基等有害物質(zhì)，需要產(chǎn)生更多的保護(hù)酶并表現(xiàn)出更高的活性所致。

高秀華，孔祥強(qiáng)，趙彥修，張慧．2006．鹽芥EMS突變體創(chuàng)制的探討．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，34（20）：5189-5190，5193．

和江明，王敬喬，陳薇，李根澤，寸守銑．2004．EMS對(duì)甘藍(lán)型油菜離體小孢子胚胎發(fā)生能力的影響．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，17（6）：690-693．

李合生．1999．植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)．北京：高等教育出版社：67-69．

毛培勝，常淑娟，王玉紅，廉佳杰．2008．人工老化處理對(duì)羊草種子膜透性的影響．草業(yè)學(xué)報(bào)，17（6）：66-70．

王長(zhǎng)里，付晶，楊學(xué)舉．2008．EMS誘導(dǎo)小麥突變體的研究及展望．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，36（19）：8038-8039．

王幼平，徐曉霞，高宏波，藍(lán)樂(lè)夫．1999．EMS和60Co對(duì)海甘藍(lán)種子萌發(fā)及其M1代農(nóng)藝性狀的影響．木本植物研究，19（1）：64-67．

原小燕，李加納，劉列釗．2010．EMS對(duì)油菜種子萌發(fā)的影響．西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，35（3）：217-221．

張志良．2000．植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)．北京：高等教育出版社：123-124．

趙世杰，許長(zhǎng)成，鄒琦，孟慶偉．1991．植物組織中丙二醛測(cè)定方法的改進(jìn)．植物生理學(xué)通訊，30（3）：207-210．

Feiz L，Beecher B S，Martin J M，Giroux M J．2009a．In planta mutagenesis determines the functional regions of the wheat puroindoline proteins．Genetics，183（3）：853-860．

Feiz L，Martin J M，Giroux M J．2009b．Creation and functional analysis of new puroindoline alleles in Triticum aestivum．Theoretical and Applied Genetics，118（2）：247-257．

Ferrie A M R，Taylor D C，Mackenzie S L，Rakow G，Raney W A．2008．Microspore mutagenesis of Brassica species for fatty acid modifications：a preliminary evaluation．Plant Breeding，127：501-506．

Slade A J，F(xiàn)uerstenberg S I，Loeffler D，Steine M N，F(xiàn)acciotti D．2005．A reverse genetic，nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING．Nature Biotechnology，23（1）：75-81．

Smith M T，Berjak P．1995．Deteriorative changes associated with the loss of viability of stored desiccation tolerant and sensitive seeds// Kigel J，Galili G．Seed Development and Germination．New York：Marcel Dekker Inc：701-704．

Stephenson P，Baker D，Girin T，Perez A，Amoah S，King G J，?stergaard L．2012．A rich TILLING resource for studying gene function in Brassica rapa．BMC Plant Biology，10：62．

Wang N，Wang Y J，Tian F，King G J，Zhang C Y，Long Y，Shi L，Meng J J．2008．A functional genomics resource for Brassica napus：development of an EMS mutagenized population and discovery of FAE1 point mutations by TILLING．New Phytologist，180（4）：751-765．

Abstract：Taking Chinese cabbage‘Jinyu 80’and‘99-2’as experimental material，studied the effect of different EMS concentration treatments on seed germination，seedling growth，and major biochemical indexes of both seed and seedling．The results showed that within the scope of 0-1.0% concentration，the germination potential and germination rate of Chinese cabbage seeds were decreased，the seedling root tip and cotyledon edge gradually turned to brown．The seedling surviving rate was decreased gradually，and the conductivity value of seed leachate and MDA contents in seed and seedling were all increased gradually．The EMS effect on SOD and POD activities of seed and seedling were expressed as low concentration with promotion，and high concentration with inhibiton．The optimal EMS concentration for Chinese cabbage seed treatment was ranged from 0.4%-0.6%．

Effects of EMS Treatment on Germination and Biochemical Characteristics of Chinese Cabbage Seed

LU Yin，LIU Meng-yang，WANG Yan-hua，LUO Shuang-xia，XUAN Shu-xin，ZHAO Jian-jun，SHEN Shu-xing*

（College of Horticulture，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，Heibei，China）

Chinese cabbage；EMS；Germination rate；SOD；POD；MDA

盧銀，女，博士研究生，講師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：luagzoujidong@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：申書(shū)興，男，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：shensx@hebau.edu.cn

2014-01-16；接受日期：2014-02-25

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA100202-5），農(nóng)業(yè)科研杰出人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目