(南華大學醫(yī)學院腫瘤研究所,湖南衡陽421001)

目前,腫瘤相關疾病是人類死亡的首要原因[1],嚴重影響人類生命健康,因此,深入探討其發(fā)病機制重要且必要。MicroRNA(miRNA)是由21～25個核苷酸組成的單鏈非編碼小RNA,其主要功能是通過介導靶基因轉錄體的降解抑制其翻譯,即從轉錄后水平上抑制相關基因的表達,影響細胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡等多種生理病理過程。miRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。MiRNA廣泛分布于動植物基因組中,其表達具有高度保守性、時序性和組織特異性[2]。一個miRNA能夠調控數(shù)百個基因,因此研究miRNA在實體腫瘤中調控機理復雜。

1 miR-210的基本特征與生物學功能

人miR-210位于染色體11p15.5,序列為“CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA”。在低氧條件下miR-210抑制細胞增殖;它也可使氧化磷酸化的代謝過程向糖酵解轉化,從而抑制線粒體的呼吸代謝,最終導致長時間抑制細胞的新陳代謝;miR-210可以直接結合DNA損傷修復基因RAD家族中RAD52的3′-UTR區(qū)域通過抑制其翻譯從而減弱DNA損傷修復的能力[3];細胞周期轉錄因子E2F家族在調控細胞周期進程中發(fā)揮著核心作用,miR-210能夠通過E2F家族成員E2F3和Myc依賴性轉錄激活和細胞生長拮抗因子(antagonist of Myc-dependent transcriptional activation and cell growth,MNT)的活性來調控細胞周期進程;另外,miR-210還具有促進血管新生的作用等功能[4]。由此可見,miRNA-210的功能多且對機體影響大,因此,深入探討miRNA-210的新功能及在腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制有十分重要的意義,將為腫瘤的臨床治療和治療提供新的思路。

2 miR-210與低氧的關系

低氧是腫瘤微環(huán)境的標志之一,越來越多的研究表明低氧微環(huán)境是導致腫瘤臨床治療效果差的主要因素之一[5],它能夠增強腫瘤細胞對放化療的抵抗,同時也使其更易發(fā)生侵襲和轉移。多個miRNA參與了低氧反應過程,而miR-210是低氧條件下反應變化最為顯著的miRNA之一[6]。研究表明,miR-210能由低氧誘導因子(hypoxia-inducible factors,HIF)所調控,具體機制為HIF-1α在接近 miR-210啟動子處直接與轉錄起始位點上游大約400bp的乏氧反應元件(hypoxia responsive element,HRE)結合,從而誘導其在實體瘤中大量表達。Puissegur等[7]研究證實：細胞在缺氧處理48～72小時后,抑制miR-210會降低HIF-1α的蛋白水平,而依賴于miR-210靶向的SDHD可以激活HIF-1,從而有助于HIF在低氧條件下的高表達,HIF-1上調的同時能夠促進血管內皮生長因子(endothelial growth factor,VEGF)和miR-210表達變化,表明miR-210與HIF形成了一個前饋回路?？傊?miR-210已經(jīng)作為體內的低氧信號因子,參與多種信號途徑的調控(圖1)[8],且與腫瘤患者的不良預后密切相關,因此探討miR-210在實體腫瘤中的表達情況有助于腫瘤的臨床診斷和個體化治療。

圖1 低氧誘導的miR-210參與調控信號通路

3 miR-210在實體腫瘤中的研究

3.1 非小細胞肺癌

Puissegur等[7]利用miRNA熒光定量技術檢測20例非小細胞肺癌組織(non-small cell lung cancer,NSCLC),研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC晚期階段miR-210的表達與正常組織相比顯著增加。同樣,通過檢測體外低氧處理非小細胞癌細胞系A549細胞發(fā)現(xiàn),與對照組比較miR-210的表達也明顯上調。此外,A549細胞具有較強的抵抗放射線的能力,這與其中miR-210的大量表達密切相關,因為在放射線照射情況下miR-210能夠高效修復雙鏈斷裂(doublestrand breaks,DSBs)[9]的基因,這也是miR-210的高表達導致NSCL患者對放化療治療不敏感的機制之一。痰細胞學檢測發(fā)現(xiàn),在NCSL患者的痰液細胞中miR-210大量表達,這為NCSL患者的早期診斷提供了重要的依據(jù)[10]。通過原位雜交技術檢測miR-210不單在NSCL的腫瘤細胞中表達,也在間質細胞中表達。這兩種細胞miR-210的共表達能夠作為疾病的預后生存指標[11]?？傊?miR-210的表達對NSCL患者的早期臨床病理診斷和預后評估有十分重要意義[12]。

3.2 乳腺癌

研究表明在體外分別給予乳腺癌細胞系MCF7、SKBR3和MDAMB231細胞0.1%的O2處理后發(fā)現(xiàn),這三個細胞系中外切體酶(外切體酶(Exosome)是一種可由多種細胞分泌的納米量級的膜性小囊泡,它在腫瘤間質細胞的相互作用以及誘導抗腫瘤免疫反應的過程中發(fā)揮重要作用[13])均大量表達,且在低氧誘導的外切體酶能導致miR-210的表達明顯上調[14]。Tadokoro等[15]報道外切體酶可能是通過miR-210促進內皮細胞血管生成以及抑制DNA修復來發(fā)揮腫瘤細胞對低氧的應答反應,這也可能是癌變的機制之一。

另有,Toyama等[16]研究對161例乳腺癌進行生存變量的分析得出結論,miR-210作為一個獨立因素預示：miR-210低表達組的預后要優(yōu)于miR-210高表達組。因此,miR-210既可作為乳腺癌診斷參考指標,也可作為預后的評判指標。

3.3 胰腺癌

胰腺癌是一種預后極差的惡性實體腫瘤,5年生存率低于5%。因此,挖掘新的治療靶點對提高胰腺癌的治療效果十分必要。陳等[17]利用RT-PCR技術檢測胰腺癌細胞系發(fā)現(xiàn),miR-210能夠被低氧誘導大量表達。利用小干擾RNA技術沉默胰腺癌細胞HIF的表達后發(fā)現(xiàn),miR-210的表達水平明顯下降[18],這再次證實HIF誘導miR-210的高表達。目前,關于在胰腺癌中關于miR-210的研究主要集中在miR-210誘導、調節(jié)分子機制以及在臨床診斷中的價值。

3.4 腎細胞癌

White等[19]通過微陣列分析和RT-PCR方法分析了70組腎透明細胞癌(Clear cell renal cancer,CCC)和正常腎組織,結果表明在所有升高的miRNAs中miR-210的表達尤為顯著。在腎細胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)中沉默miRNA-210的表達,研究發(fā)現(xiàn)RCC的侵襲轉移能力顯著下降,暗示高表達的miRNA-210能夠促進RCC的侵襲與轉移。另外,miRNA-210能調控細胞周期[20]。趙[21]等通過臨床監(jiān)測發(fā)現(xiàn),在RCC常規(guī)手術后一周血清miRNA-210的表達明顯下降,因此,miRNA-210也可作為RCC患者手術成功與否的參考指標。

3.5 食管鱗狀細胞癌

與上述實體腫瘤的表達形式不同,miR-210在食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)組織來源細胞中的表達是下調的[22],特別是在低分化的ESCC中,miR-210的下調尤為顯著,因此,miR-210可能與ESCC的分化程度有關。深入研究發(fā)現(xiàn)[23],miR-210抑制癌細胞的增殖是通過誘導細胞凋亡以及阻礙G1/G0和G2/M期的細胞周期。通過轉錄芯片和生物信息分析以及qRTPCR、Western blot的驗證,確定了成纖維細胞生長因子(fibroblastgrowthfactorreceptor-like1,FGFRL1)在ESCC中的表達水平與miR-210呈顯著負相關。免疫組織化學染色實驗初步確定FGFRL1基因是miR-210的靶基因,軟件預測發(fā)現(xiàn)FGFRL1基因3′-UTR 5個位點都是miR-210的靶位點,因此得出FGFRL1基因是miR-210的靶基因之一。但是FGFRL1的功能具有促進細胞周期的G1/G0期最終導致癌細胞的增殖。在ESCC中,低表達的miR-210能夠能上調FGFRL1的表達水平,從而促進癌細胞的增殖,這也就暗示了miR-210可能具有抑制ESCC細胞增殖分化的作用。因而,下調的miR-210可能是導致ESCC細胞增殖加快的機制之一。

3.6 其他實體腫瘤

除上述腫瘤外,miR-210在口腔腫瘤[24]、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[25]、腎上腺皮質癌[26]、結腸癌[27]、卵巢癌[28]、成膠質細胞瘤[29]、惡性黑色素瘤[30]中也有表達。但是miR-210在這些實體腫瘤中的表達狀態(tài)并不一致,甚至在同一腫瘤不同細胞系中的表達水平也不相同。由此我們認為,miR-210在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的功能具有多方面的,致病機制也十分復雜。

4 miR-210調控實體腫瘤的分子機制研究

4.1 低氧/miR-210/VMP1通路

Ying等[25]應用Target Scan等軟件預測空泡質膜蛋白(vacuole membrane protein 1,VMP1)是miR-210作用靶標之一。熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)深入證實 miR-210能與 VMP1的3′-UTR直接結合。VMP1首次在急性胰腺炎中被發(fā)現(xiàn)[31,32],不僅能促進空泡細胞的形成以及腺泡細胞的凋亡[33,34],也能夠促進胰腺癌細胞的凋亡[35]。研究發(fā)現(xiàn),通過siRNA技術沉默VMP1的表達能夠顯著提高腎癌細胞的侵襲轉移。同樣,在HCC中VMP1也是低表達的,而高表達VMP1的可降低肝癌細胞的轉移以及侵襲[25]。研究發(fā)現(xiàn),由低氧誘導的miR-210能夠促進HCC的轉移和侵襲,當下調miR-210的表達后,在低氧條件下HCC的轉移及侵襲均顯著下降。綜合得出,miR-210與VMP1的作用相反,提示低氧誘導的miR-210能夠通過與VMP1直接結合影響HCC的轉移和侵襲。另外,VMP1能夠逆轉由miR-210介導的HCC的轉移及侵襲,在高表達miR-210的HCC中轉染VMP1后,與空轉染組比較HCC的轉移及侵襲均明顯下降。但是將miR-210的反義寡核苷酸轉染到 Huh-7細胞中后發(fā)現(xiàn),由低氧導致的VMP1表達的下調作用得到逆轉,由此表明,在低氧環(huán)境下VMP1表達的下調是由上調的miR-210介導的[25]?？傊?低氧環(huán)境下,miR-210可以通過下調VMP1的表達促進腫瘤細胞的侵襲轉移(圖2)。

圖2 低氧誘導的miR-210在實體腫瘤中的調控機制

4.2 低氧/miR-210/VEGF通路

Foekens等[36]用生物信息學分析38例乳腺癌患者發(fā)現(xiàn),miR-210與低氧/VEGF信號通路偶聯(lián)(圖2)。VEGF廣泛表達于腎癌,乳腺癌,黑素瘤,肝癌,胃癌,膀胱癌,子宮內膜癌及胚胎組織性腫瘤及非腫瘤的病理過程中,與轉化生長因子B(TGFB),血小板源性生長因子(PDGF),NO及一些重金屬離子有關,VEGF受缺血和缺氧環(huán)境的調節(jié)。研究發(fā)現(xiàn),瘤體組織VEGF的表達水平與其微血管密度及惡性程度成正相關,并明顯高于非腫瘤組織。這表明VEGF通過促進血管生成的方式促進腫瘤生成,尤其在高度血管化腫瘤中。近期研究發(fā)現(xiàn),低氧誘導的胰腺癌患者的血清中同時檢測到VEGF和miR-210的大量表達[37]。當給予VEGF的抑制劑后不但可以阻斷VEGF的表達,也能夠阻斷miR-210的表達,由此表明,低氧誘導的miR-210的大量表達與低氧相關下游靶點VEGF密切相關[37]。但是,兩者在腫瘤發(fā)生過程中究竟哪一個占主導作用目前還不清楚。

4.3 低氧/ROS/miR-210/ROS通路

目前研究發(fā)現(xiàn),低氧誘導的miR-210的表達可以被活性氧的清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)所衰減,表明低氧增加的miR-210的表達主要由活性氧(reactive oxygen species,ROS)介導產生。ROS可雙向調控某些腫瘤細胞的凋亡和增殖。最新研究發(fā)現(xiàn),低濃度的ROS更廣泛的生理意義在于其對轉錄因子的激活以及對細胞增殖、分化的促進。研究表明,低氧誘導ROS通路的活化能夠促進miR-210的表達(圖2),進而影響脂肪組織來源干細胞(Adipose tissue-derived stem cells,ASCs)的轉移和增殖[38]。而miR-210可以通過下調鐵硫簇支架蛋白(iron-sulfur cluster scaffold homolog 1/2,ISCU1/2)以及非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶2(protein tyrosine phosphatase,non-receptor type 2,PTPN2)的表達反饋調節(jié)ROS的表達,也就是說,ROS與miR-210兩者在腫瘤細胞的增殖及轉移過程中能夠形成前饋回路[38]。這對腫瘤細胞在侵襲以及轉移的過程中具有非常重要的意義。

4.4 miR-210/FGFRL1/G1-G0通路

在ESCC中,miR-210能夠通過下調FGFRL1的表達阻滯細胞周期G1/G0期,抑制ESCC的增殖。但是miR-210通過FGFRL1阻礙細胞周期進程達到抑制癌細胞增殖的作用只是部分的[23],暗示著miR-210還可能通過其他的靶標基因抑制癌細胞的增殖(圖2)。

4.5 miR-210/ISCU1/2/ETC通路

鐵硫簇支配蛋白1/2(iron-sulfur cluster assembly proteins1/2,ISCU1/2)是一類重要的蛋白,以鐵硫復合物為輔基,參與細胞電子傳遞過程,在細胞氧化還原反應中發(fā)揮重要作用。采用生物信學分析發(fā)現(xiàn)miR-210與ISCU1/2的3′-UTR端靶向結合,且在低氧條件下,上調的miR-210能夠抑制ISCU1/2的表達,進而抑制線粒體的電子傳遞(electron transport chain,ETC)(圖2)及三羧酸循環(huán)。盡管miR-210/ISCU1/2調節(jié)機制在各種細胞中均存在,但是其生物能量利用率仍受細胞環(huán)境影響[39],例如,相對于非轉化細胞,腫瘤細胞中糖酵解速率增加,氧化磷酸化速率減弱,該過程受miR-210/ISCU1/2機制調控[40],尤其是在HIF高表達的腎腫瘤細胞中。因此,研究低氧環(huán)境中miR-210/ISCU1/2/ET對腫瘤細胞代謝過程的調控機制復雜,有待深入研究。

5 展 望

近年關于miR-210在低氧環(huán)境中對實體腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究十分廣泛,miR-210在腫瘤細胞的增殖、轉移以及侵襲過程中具有多種作用與功能。對于研究miR-210的手段多采用計算機預測靶基因3′-UTR與miR-210的種子序列的互補性、微陣列分析技術和AGO蛋白免疫沉淀法(argonaute protein immunoprecipitation,miRNP-IP)以及 miR-210的定量分析法,這些都將為全面研究miR-210的功能提供重要的實驗方法。miR-210的腫瘤機制研究也已經(jīng)擴展到炎癥方面,因此,深入探討miR-210的調控機制將為實體腫瘤的臨床治療提供更廣闊前景。

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