毛穎穎　汪洪波　劉海平

摘要：目的：選取低氧反應基因——誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）基因序列上rs10459953、rs1060822單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）位點，研究其與低氧訓練后生理表型指標關聯(lián)性。方法：采用關聯(lián)研究方法（Association-Study），聚合酶鏈反應-限制片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）實驗解析技術，選取35名健康受試者在模擬海拔2500 m高度進行4 周高住-高練-低訓（living high-exercise high-training low， Hi-Hi-Lo）。研究iNOS基因SNP rs10459953和SNPrs1060822與低氧訓練后最大攝氧量（maximal oxygen uptake，VO2max）、血紅蛋白（hemoglobin， Hb）、紅細胞數(shù)（red blood cell， RBC）等生理表型指標關聯(lián)性。結果：1）4周低氧訓練后，SNP rs10459953不同基因型之間VO2max 、Hb、RBC變化量均無顯著性差異。2）4 周低氧訓練后，SNP rs1060822不同基因型間Hb、RBC變化量有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中CT 基因型受試者Hb、RBC顯著增加（P<0.05），且在低氧環(huán)境下定量負荷實驗中，SNP rs1060822 的CT基因型受試者低氧訓練后期SpO2動態(tài)曲線顯著高于初期（P<0.05）。結論：iNOS基因 SNP rs1060822與低氧訓練后血象指標存在一定關聯(lián)性，CT基因型表現(xiàn)出一定優(yōu)勢。

關鍵詞：誘導型一氧化氮合酶；單核苷酸多態(tài)性；低氧訓練

中圖分類號：G804.7文獻標識碼：A文章編號：1006-2076（2014）01-0085-05

低氧訓練能提高耐力項目運動員的有氧運動能力，這已被國內外學者所認同。但由于個體對低氧生理反應的差異性，會產(chǎn)生不同的低氧訓練適應效果[1]，且低氧訓練效果差異性與遺傳學因素有關。Pasha 等證實，高原病的易感率以及人類對低氧環(huán)境的適應能力與相關低氧反應基因多態(tài)性有關[2-3]。

山東體育學院學報第30卷第1期2014年2月 毛穎穎，等iNOS基因rs10459953/rs1060822多態(tài)性與低氧訓練效果的關聯(lián)性研究No.1 2014 一氧化氮合酶（nitric oxide synthase ， NOS）在體內的主要生物學作用是催化L2精氨酸氧化生成一氧化氮（nitric oxide ， NO），NO是一種可在細胞間自由擴散的信使分子，參與心血管、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)功能的調節(jié)。大量研究證實，NOS活性增強，促進生成的NO可促進運動過程中葡萄糖轉運至骨骼肌，改善運動肌內血流量[4-5]。此外，iNOS基因啟動子上有一段與低氧反應增強子（Hypoxia-Responsive Enhancer， HRE） 同源的序列，因此，iNOS表達可對細胞感受低氧調節(jié)發(fā)揮一定作用[6]。因此，iNOS基因多態(tài)性可能與低氧訓練適應遺傳因素有關。

本研究選取iNOS基因5端非編碼區(qū)的SNP rs10459953和第20外顯子2622bp處的SNP rs1060822 兩位點，研究其與低氧訓練后生理表型指標的關聯(lián)性，以探尋低氧訓練個體差異性的遺傳學標記。

1對象與方法

1.1受試對象

本研究選取35名健康受試者（男性23名，女性12名），平均年齡19.54±2.55歲，平均身高177.94±4.27 cm，平均體重68.07±5.579 kg，均系中國北方漢族健康人群，無低氧暴露經(jīng)歷。

1.2低氧運動方案

受試者居住于常壓低氧環(huán)境，每天晚上20：00至次晨6：30在氧濃度為15.4%低氧房內（相當于海拔2500 m）休息和睡眠，低氧暴露時間≥10 h/天，白天在海拔50 m的常氧環(huán)境下學習生活，共進行4周實驗。低氧實驗期間，進行每周3次，每次30分鐘的蹬功率自行車低氧定量負荷運動，以基礎VO2max70%強度為運動負荷，功率自行車轉速為60轉/分。

1.3測試方案

1.3.1生理指標測試

生理指標測試：低氧實驗前后分別進行1次最大攝氧量（maximal oxygen uptake， VO2max）、血象指標（hematological parameters）、低氧定量負荷實驗下血氧飽和度（oxygen saturation， SpO2）的測試。VO2max測試采用遞增負荷實驗進行，起始負荷60 W，功率車轉速為60 RPM，每3分鐘遞增30 W，直至力竭，VO2max判定標準以心率超過180 b/min，呼吸商超過1.1，VO2不再增加，受試者不能保持蹬車頻率等因素綜合確定；血象指標測試是受試者晨空腹取靜脈血0.5 ml，采用BECKMAN STKS型全自動血細胞分析儀進行測試分析，主要包括紅細胞（RBC）、血細胞壓積（Hct）、血紅蛋白（Hb）等；SpO2采用定量負荷實驗，即受試者在15.4%O2低氧環(huán)境下，以70%基礎VO2max強度進行蹬功率自行車，功率自行車轉速為60 RPM，持續(xù)運動時間21min，記錄安靜時、運動中每3min及恢復期間1min、3min的SpO2。

1.3.2基因多態(tài)性分析

取靜脈血2 ml，2% EDTA抗凝，用promega公司全血總DNA提取專用試劑盒提取受試者DNA，對iNOS基因SNP rs10459953及rs1060822進行分析。

1.3.2.1iNOS基因SNP rs10459953分析 依據(jù)人類iNOS基因序列，用Primer 5. 0設計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物：5--GGAAGAAACAAAACCCTCT-3-；下游引物：5--CCTGGCAGTCACAGTCATA-3-。20 μLPCR反應體系擴增，包括：10×PCR 2 μL， 25 mM MgCl2 1.2 μL，dNTP各10mM 1 μL，上、下引物各10 pmol0.5 μL，Taq酶1 U，模板100 ng。各種藥品均為上海生工產(chǎn)品。

擴增方案是：1）94°C預變性5 min；2）94 °C變性40 s，54 °C退火40 s，72°C延伸40 s，35 個循環(huán)；3）72°C延伸10 min。擴增產(chǎn)物為405 bp 片段。限制性內切酶分析：EagI 在37°C 1 h消化擴增產(chǎn)物，3%瓊脂糖電泳，溴化乙錠（ethidium bromide， EB）染色，凝膠成像系統(tǒng)紫外光成像（上海天能）。

1.3.2.2iNOS基因SNP rs1060822分析 依據(jù)人類iNOS基因序列，用Primer 5. 0設計引物， 引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物：5--AAATGAAAGGAGGGCACA-3-；下游引物：5--CACCACTCGCTCCAGTAT-3-。20 μLPCR反應體系擴增，包括：10×PCR Buffer 2 μL，25 mM MgCl2 1.2 μL，dNTP各10 mM 1 μL，上、下引物各10 pmol0.5 μL，Taq酶2 U，模板100 ng。各種藥品均為上海生工產(chǎn)品。

擴增方案是：1）94°C預變性5 min；2）94℃變性40 s，52℃退火40 s，72°C延伸40 s，35 個循環(huán)；3）72°C延伸10 min。擴增產(chǎn)物為232 bp 片段。限制性內切酶分析：AccI 在37°C 1h消化擴增產(chǎn)物，3%瓊脂糖電泳，溴化乙錠（ethidium bromide， EB）染色，凝膠成像系統(tǒng)紫外光成像（上海天能）。

1.4數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以±SD表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理采用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計包（SPSS software for Windows 11.5 package）完成。受試者人群的基因型頻率是否符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律采用卡方檢驗（chi-test）統(tǒng)計；低氧訓練前后生理指標數(shù)據(jù)先用K-S檢驗是否符合正態(tài)分布，如符合進行下面統(tǒng)計學處理：低氧訓練前、后基因型之間的生理指標差異用單因素分析（ANOVA）處理，當基因型只有兩種時，采用獨立樣本t檢驗處理，組間的兩兩比較采用Post-Hoc處理；基因型之間生理指標的變化量采用協(xié)方差處理，以低氧訓練前的初始值作為協(xié)變量進行分析，分析不同基因型受試者進行定量負荷實驗時SpO2的變化差異，采用兩因素重復測量方差處理（基因型X時間），基因型組同一時間點SpO2的比較，采用獨立樣本t檢驗處理。顯著水平設為P<0.05。

2結果

2.1iNOS基因SNP rs10459953、rs1060822分析結果

35名受試者iNOS基因SNP rs10459953、rs1060822解析結果顯示，SNP rs10459953位點中，GG基因型頻率占31%，GC基因型頻率占49%，CC基因型頻率占20%，G等位基因頻率為44%，C等位基因頻率為56%。SNP rs1060822位點中，CC基因型頻率占11%，CT基因型頻率占83%，TT基因型頻率占6%，C等位基因頻率為53%，T等位基因頻率為47%。卡方檢驗結果表明，SNP rs10459953基因型頻率符合Hardy-weinberg遺傳平衡，而SNP rs1060822位點不符合Hardy-weinberg遺傳平衡，可能是由于樣本量過少（圖1）。

2.2iNOS基因SNP rs10459953與低氧訓練后生理表型指標的關聯(lián)變化

低氧訓練前后，測試所有35名受試者VO2max、Hb、RBC 等生理生化指標，結果顯示，低氧訓練前，SNP rs10459953不同基因型之間最大攝氧量的絕對值存在顯著性差異（P<0.05），組間兩兩比較結果顯示，GC基因型明顯高于GG基因型（3594.07±295.11 vs 3102.31±499.84 ml/min，P=0.002）；GC基因型與CC基因型相比無顯著性差異；低氧訓練后，各基因型組間VO2max、Hb、RBC變化均未顯現(xiàn)統(tǒng)計學意義。

2.3iNOS基因SNP rs1060822與低氧訓練后生理表型指標的關聯(lián)變化

SNP rs1060822不同基因型實驗前后生理指標變化結果見表2。低氧訓練前各基因型組間VO2max、Hb、RBC 等生理表型指標無明顯變化。低氧訓練后，SNP rs1060822各基因型組間ΔHb、ΔRBC存在顯著性差異（P<0.05），兩兩比較發(fā)現(xiàn)，CT基因型Hb增加幅度明顯高于CC基因型（1.70±6.63 vs -12.36±5.85 g/L，P<0.05）；ΔRBC的組間兩兩比較結果顯示，CT基因型增加幅度明顯高于CC基因型（0.25±0.41 vs -0.28±0.32×1012/L，P<0.05）；CT基因型群體ΔHb、ΔRBC與TT基因型群體相比差異無顯著性，但從升高幅度的趨勢上分析，CT基因型相比具有一定優(yōu)勢。表2iNOS基因SNP rs1060822 C/T低氧訓練后生理表型指標變化±SD

2.4低氧定量負荷實驗中SpO2指標的變化

低氧訓練前后，低氧環(huán)境下定量負荷實驗過程SpO2動態(tài)變化結果見圖2，SNP rs10459953的GG和GC基因型受試者低氧訓練前后SpO2變化存在顯著性差異（P<0.05），后期定量負荷實驗過程中GG和GC型受試者SpO2動態(tài)曲線處于較高水平；SNP rs1060822 的CT基因型受試者低氧訓練前后SpO2動態(tài)曲線變化存在顯著性差異（P<0.05），后期定量負荷實驗過程中SpO2動態(tài)曲線顯著高于初期。

圖2iNOS基因SNP rs10459953 和SNP rs1060822多態(tài)位點不同基因型受試者低氧訓練前后定量負荷實驗期間SpO2動態(tài)變化曲線

3討論

NO 是體內的一種氣體信號分子，它對于血管舒張，促進血液循環(huán)有明顯作用[7]，且可以調節(jié)內皮細胞、平滑肌細胞和神經(jīng)細胞的功能，同時也參與低氧時細胞內某些低氧敏感基因表達的調節(jié)[8]。iNOS是體內合成NO關鍵限速酶，在血管內皮局部受到損傷時，iNOS在嚴格控制下的誘導表達對于補償內源性NO不足、恢復正常血管功能具有重要意義[9]。近年來，關于iNOS基因多態(tài)性研究多集中于臨床疾病方面，與低氧訓練、低氧適應效果個體差異性的研究甚少。

人體iNOS 基因位于第17 號染色體長臂（17q11.2～17q12），全長約37kb，含有26 個外顯子。本研究選取的SNP rs10459953位于iNOS基因5端非編碼區(qū)，該區(qū)域為一段連接第一外顯子和啟動子的非編碼序列，雖不能編碼蛋白質，但對于遺傳信息的表達是必不可少，在基因轉錄和翻譯過程中有著重要的調控作用，如①保護mRNA，防止RNA酶5-3端外切酶活性對mRNA的講解；②增強mRNA的剪切和翻譯效率；③影響翻譯起始的準確性，因此，該區(qū)域多態(tài)性可能影響iNOS 基因的轉錄表達。從本研究結果發(fā)現(xiàn)，iNOS 基因SNP rs10459953雖與低氧訓練前VO2max指標存在一定關聯(lián)性，即GC基因型表現(xiàn)出一定優(yōu)勢，但與低氧訓練后VO2max、RBC、Hb等生理指標變化并未有明顯關聯(lián)。關于此位點與低氧環(huán)境適應的關聯(lián)研究尚未見報道，僅有臨床研究認為[10]，iNOS 基因SNP rs10459953與良性前列腺增生有關。

本研究發(fā)現(xiàn)，SNP rs1060822位點與低氧訓練后RBC和Hb指標有明顯關聯(lián)，CT基因型受試者在低氧訓練Hb和RBC變化量明顯好于其它基因型，CT基因型受試者低氧訓練后Hb、RBC分別提高1.16%、5.35%，而CC、TT基因型分別降低8.39%、5.93%和1.23%、2.66%，且CT基因型受試者在低氧定量負荷實驗過程中SpO2變化也具有一定優(yōu)勢。本研究選取的SNP rs1060822位于17號染色體長臂，iNOS基因第20外顯子2622bp處，屬于同義突變。同義突變是指DNA一維序列發(fā)生單個堿基的置換，但由于遺傳密碼子的兼并性，并不引起翻譯時氨基酸的改變。傳統(tǒng)觀念認為，由于同義突變未導致氨基酸一級結構改變，就不影響蛋白質的高級結構，因而不引起蛋白質功能變化。近年來隨著對基因調控區(qū)、翻譯起始密碼子附近區(qū)域及內含子等翻譯區(qū)突變的研究逐步深入，發(fā)現(xiàn)同義突變雖不引起氨基酸序列的改變，但基因編碼區(qū)內出現(xiàn)的SNP或同義突變可由于同一氨基酸對簡并密碼子的翻譯效率不同，或轉錄水平的差異而導致蛋白質表達量上的改變，因此，SNP rs1060822同義突變也可能通過轉錄、轉錄后翻譯及翻譯后加工等多環(huán)節(jié)中的某些步驟而引起iNOS蛋白質表達量的變化。Yoneda M等[11]對于SNP rs1060822研究發(fā)現(xiàn)，攜帶T等位基因非酒精性脂肪肝受試者的肝活檢標本中iNOS mRNA的表達增加，iNOS表達增加可能與機體細胞感受低氧有關，有研究報道，iNOS基因的啟動子上有一段與低氧反應增強子（Hypoxia-Responsive Enhancer， HRE） 同源的序列，稱iNOS-HRE，可以誘導iNOS-HRE 的活性[6]。同時，HIF-1識別iNOS-HRE并與之結合，介導低氧反應，使腎臟產(chǎn)生EPO增多，致使血漿、血清EPO濃度升高，并與紅系祖細胞膜上EPOR結合，促進紅系祖細胞由早期紅系祖細胞（BFU-E）到晚期紅系祖細胞（CFU-E）的增殖分化，最終形成成熟的紅細胞釋放入血，加強體內氧氣運送，改善組織、器官氧水平。這可能是iNOS基因SNP rs1060822位點與低氧訓練血象指標關聯(lián)的機制。此外，SNP rs1060822 的CT基因型受試者低氧訓練前后期定量負荷實驗過程中SpO2動態(tài)曲線顯著高于初期，也表明CT基因型受試者具有良好的低氧訓練生理效果，這與血象指標變化相一致。有研究報道，低氧環(huán)境下運動時，具有較高SpO2水平的個體，其表現(xiàn)出較好的低氧適應及低氧運動能力[12]。但本研究并未觀察到SNP rs1060822與VO2max指標關聯(lián)，其原因有待于進一步研究。

4結論

低氧訓練后，SNP rs1060822攜帶CT 基因型受試者ΔHb、ΔRBC顯著增加；且在低氧訓練后定量負荷實驗過程中SpO2變化也表現(xiàn)一定優(yōu)勢；SNP rs10459953與個體低氧訓練后生理表型指標無關聯(lián)。

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