王文濤，何鑫淼，張冬杰，彭福剛，吳賽輝，劉 娣

(黑龍江省農業(yè)科學院，黑龍江哈爾濱 150086)

CystatinB(又稱為stefin B)是半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族Ⅰ(cystatin)中的一類特異性可逆抑制因子[1]，廣泛分布于多種組織中[2]，被認為是最重要的胞內組織蛋白酶抑制劑之一[3]，由一條長度約為100個氨基酸的多膚鏈構成，不含二硫鍵和糖基，分子量約11～12 kD[4]。在豬上，CstB基因已經獲得全Cds序列[5]。筆者利用已知外顯子序列設計引物，采用RT-PCR的方法對大白豬、野豬及野家雜交豬背肌組織中CstB基因表達情況進行研究?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。大白豬、野豬及野家雜交豬，來自黑龍江省農業(yè)科學院畜牧研究所養(yǎng)殖場。

1.1.2主要試劑。Trizol Reagent，購自Invitrogen公司；焦碳酸二乙酯，購自Sigma公司；瓊脂糖，購自西班牙Agarose公司；胰蛋白胨、酵母抽提物、溴化乙錠、氯化鈉、無水乙醇、氯仿、異丙醇、三羥基氨基甲烷、乙二胺四二酸二鈉等均為國產分析純，市售。

1.2RT-PCR技術檢測試驗豬采取不同品種豬各3頭，

取背肌組織樣品，采用TRIzol法提取總RNA，反轉錄為cDNA。設計引物F：5′-AGC ACA TCG CCG ACC AGG-3′；R：5′-GGC TTG TTC TCG TGC GGG-3′。反應條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，40 s；共30個循環(huán)。再于72 ℃，10 min，4 ℃保存。采用5 μl PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，并以Quantity-One軟件以光密度吸收測定法進行目的基因表達的定量分析。

2 結果與分析

2.1總RNA的檢測結果提取的總RNA在2%瓊脂糖凝膠電泳中檢測，結果如圖1，驗證RNA提取成功。

圖1 組織總RNA電泳結果

圖2 PCR循環(huán)數與產量的關系

2.2循環(huán)參數的確定PCR擴增背肌組織中CstB基因，起始循環(huán)數從21開始，模板為1 μl PCR產物，每隔1個循環(huán)將反應管拿出1管，直至30個循環(huán)，PCR反應后在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，確定循環(huán)數未達到平臺期。圖2表明，循環(huán)參數為27。

2.3不同豬種背肌組織中CstB基因的表達結果采用RT-PCR方法檢測1日齡、90日齡、180日齡、270日齡、360日齡大白豬，90日齡、180日齡、270日齡、360日齡、420日齡野家雜種豬以及360日齡野豬的背肌組織中CstB基因的表達情況。圖3表明，背肌中CstB基因的表達在90日齡的野家雜種豬表達量最高，其他個體相對較均衡。

圖3 Cst B基因在背肌中的RT-PCR結果

3 結論與討論

半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cystatins)能夠降低半胱氨酸蛋白酶的功能[6]，進而影響干制火腿的松軟度。試驗結果表明，背肌中CstB基因的表達在90日齡的野家雜種豬表達量最高，其他個體相對較均衡。故從蛋白酶水解的角度來說，90日齡的野家雜種豬利用背肌制作的火腿品質高于大白豬背肌制作的火腿。

[1] BRZIN J，TRSTENJAK M，RITONJA A，et al.Cysteine Proteinases and their Inhibitors[M].W.De Guyter,Berlin,NY,1986:443-453.

[2] PENNACEHIO L A，BOULCY D M，HIGGINS K M,et al.Progressive ataxia，myoclonic epilepsy and cerebellar in cystain B-deficient mice[J].Nat Genet,1998，20(3):251-258.

[3] TURK V，BODE W.The cystatins: protein inhibitors of cysteine proteinases[J].FEBS Lett,1991,285 (2):213.

[4] BARRETT A J, FRITZ H, GRUBB A,et al.Nomenclature and classification of the proteins homologous with the cysteine-proteinase inhibitor chicken cystatin[J].Bio Chem J,1986，236(1): 312.

[5] 王文濤.豬CstB基因的克隆、多態(tài)性分析及表達規(guī)律的研究[D].哈爾濱：東北農業(yè)大學，2007.

[6] LENARCIC B,KRIZAJ I,ZUNEC P,et al.Difference in specificity for the interactions of stefins A,B and D with cysteine proteinases[J].FEBS Lett,1996,395(2/3):113-118.