吳 蟬

(武漢理工大學(xué)化工學(xué)院,湖北武漢 430070)

納米技術(shù)是21世紀(jì)科學(xué)技術(shù)的象征。 由于納米尺度的特殊性，納米粒子具有許多新的物理化學(xué)特性, 如小尺寸效應(yīng)、大的比表面積、極高的反應(yīng)活性、量子效應(yīng)等[1]。近年,隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，納米粒子被廣泛地應(yīng)用到生命科學(xué)、環(huán)境、能源、日常消費(fèi)品、醫(yī)藥等領(lǐng)域中[2-3]。由于它在這些領(lǐng)域被大量地使用，不可避免地會(huì)被釋放到環(huán)境中，而人們對(duì)于納米粒子對(duì)生命體和生態(tài)環(huán)境的潛在毒性影響仍不得而知。目前，納米粒子對(duì)人類和動(dòng)物的影響已被研究[4-5]，但對(duì)于植物很少。植物作為整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的主要生產(chǎn)者，很有必要評(píng)估納米粒子對(duì)植物的影響。

納米粒子對(duì)于植物的影響不僅與納米粒子的物理化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，而且與植物種類相關(guān)。Lin等[6]研究了多壁碳納米管、鋁納米粒子、氧化鋁納米粒子、鋅納米粒子、氧化鋅納米粒子5種納米粒子對(duì)6種不同的植物(蘿卜、油菜、黑麥草、生菜、玉米、黃瓜)根生長(zhǎng)和根萌發(fā)的影響。研究表明，就根的萌發(fā)率而言，除鋅納米粒子和氧化鋅納米粒子外,其余對(duì)根的萌發(fā)沒有影響。但是，在根的伸長(zhǎng)試驗(yàn)中，各種納米粒子對(duì)各種植物的根的伸長(zhǎng)率的影響就不同。當(dāng)鋅納米粒子和氧化鋅納米粒子在濃度為2 000 mg/L時(shí)抑制所有的植物生長(zhǎng)，但對(duì)于蘿卜而言其半數(shù)致死率(IC50)濃度為50 mg/L,而對(duì)于油菜和黑麥草就只需要20 mg/L。然而，大多數(shù)的關(guān)于納米粒子對(duì)于植物的影響主要是從宏觀水平上進(jìn)行研究的[7]，通過觀察根的萌發(fā)率和根的伸長(zhǎng)率等來對(duì)其進(jìn)行評(píng)估的，而在分子層面(包括酶、蛋白質(zhì)、基因等)上，納米粒子對(duì)植物的影響研究仍很少。

為了進(jìn)一步研究納米粒子對(duì)植物的影響，選取氧化鐵納米粒子和玉米為研究對(duì)象，在分子水平上探討氧化鐵納米粒子對(duì)玉米生理效應(yīng)的影響，通過測(cè)定過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)所組成的抗氧化酶的活性和丙二醛(MDA)含量來對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。同時(shí)，研究了氧化鐵納米粒子在玉米體內(nèi)的運(yùn)輸途徑。這些結(jié)果為研究納米粒子的暴露對(duì)植物生長(zhǎng)和食物鏈的潛在影響提供一定的依據(jù)，為進(jìn)一步評(píng)估納米粒子對(duì)植物的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料氧化鐵納米粒子(nano-Fe2O3)和熒光氧化鐵納米粒子(用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記了的氧化鐵納米粒子(FITC-conjugated-Fe2O3NPs))由武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院提供,其尺寸分別為15、20 nm，如圖1、2所示。玉米種子由湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。其他試劑均購自武漢申試化工科技有限公司。

圖1 氧化鐵納米粒子的透射電鏡圖

圖2 熒光氧化鐵納米粒子的透射電鏡圖

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1種子的處理。玉米種子先用反滲透水進(jìn)行充分地洗滌，然后每30顆為一組，分別浸泡在濃度為20、50、100 mg/L的氧化鐵納米粒子的水溶液中3 h。在28 ℃下，種子在濕潤(rùn)的濾紙上萌發(fā)，當(dāng)長(zhǎng)成幼苗時(shí)移栽到不含鐵離子的全營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，然后把沒有用氧化鐵納米粒子處理的玉米幼苗分別移栽到含鐵離子全營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)作為對(duì)照。當(dāng)玉米幼苗長(zhǎng)到兩葉一新階段時(shí)，分別測(cè)定葉片中SOD、POD、CAT酶的活性和MDA含量等生理指標(biāo)。每個(gè)生理指標(biāo)重復(fù)測(cè)量3次，最終結(jié)果用平均值±方差來表示。

1.2.2SOD活性的測(cè)定。SOD普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶。測(cè)定依據(jù)是通過SOD抑制氮藍(lán)四唑(NTB)在光下的還原作用來確定酶活性。SOD粗酶提取液中加入3.5 ml磷酸緩沖液(pH 7.8，0.05 mol/L)、0.5 ml甲硫氨酸(130 mmol/L)、0.5 ml NTB(750 μmol/L)、0.5 ml EDTANa2(100 μmol/L)、0.4 ml蒸餾水。對(duì)照組用磷酸緩沖液代替SOD粗酶提取液，其余所加試劑是一樣的。當(dāng)各溶液充分混勻后，將對(duì)照組置于暗處，而其他則置于日光燈下照射20 min。最后，SOD活性是由其混合溶液在560 nm波長(zhǎng)下吸光度的變化量(△A560/(min·g))來表

示的。

1.2.3POD活性的測(cè)定。POD廣泛分布于植物的各組織中。在有H2O2存在的條件下，POD能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色的4-鄰甲氧基苯酚，可用分光光度計(jì)測(cè)定該物質(zhì)的含量來間接表示POD活性。反應(yīng)混合液包括50 ml磷酸緩沖液(pH 6.0,100 mmol/L)、28 μl愈創(chuàng)木酚和19 μl H2O2(30%)。向POD粗酶提取液中加入3.0 ml反應(yīng)混合液和1.0 ml磷酸氫二鉀，同樣用磷酸緩沖液替代POD粗酶提取液作為對(duì)照組。所得混合溶液在470 nm的波長(zhǎng)下每隔30 s測(cè)吸光度一次。POD活性可以用每分鐘吸光度的變化量(△A470/(min·g)來表示。

1.2.4CAT活性的測(cè)定。CAT能分解過氧化氫。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出CAT活性。CAT粗酶提取液被加入0.3 ml H2O2(0.1%)和3.0 ml磷酸緩沖液(pH 7.8)，同樣用磷酸緩沖液替代CAT粗酶提取液，作為對(duì)照組。所得混合液在240 nm的波長(zhǎng)下每隔30 s測(cè)吸光度一次。CAT活性由每分鐘吸光度的變化量(△A240/(min·g))來表示。

1.2.5MDA含量的測(cè)定。MDA是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物。它的積累可能對(duì)膜和細(xì)胞造成一定程度的傷害。向0.4 g葉片中加入2 ml三氯乙酸(10%)，碾磨，再加三氯乙酸定容到10 ml，離心，取上層清液。然后，吸取上層清液2 ml(對(duì)照組為2 ml蒸餾水)，加入2 ml硫代巴比妥酸(0.6%)溶液，混合物于沸水浴上反應(yīng)15 min，迅速冷卻。取上清液，測(cè)定532、600和450 nm波長(zhǎng)下吸光度，就可以求出MDA含量。

1.2.6玉米根切片的制作。在21 ℃把發(fā)育好的玉米幼苗的根浸泡在含2×10-6mg/L熒光氧化鐵納米粒子的溶液中6 d，然后取出玉米的根，用PBS緩沖液洗凈，再浸泡在濃度5%多聚甲醛溶液中4 h進(jìn)行固定，然后用鋒利的刀片進(jìn)行徒手切片，最后把制作好的植物組織切片放到熒光顯微鏡上觀察即可。而對(duì)于用于透射電鏡中觀察的切片，其前期的處理相同，只是把熒光氧化鐵納米粒子換成氧化鐵納米粒子進(jìn)行培養(yǎng)且濃度保持不變，當(dāng)被濃度5%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定后，再用濃度1%四氧化鋨進(jìn)行覆染，覆染后再在酒精中進(jìn)行脫水，最后用丙酮進(jìn)行包埋，經(jīng)過這些步驟處理過后的根用超薄切片機(jī)切片，再在透射電鏡下進(jìn)行觀察。

圖3 不同濃度氧化鐵納米粒子所對(duì)應(yīng)的玉米中抗氧化物酶的活性

2 結(jié)果與分析

2.1抗氧化物酶的活性CAT、SOD與POD是作為細(xì)胞中防御氧化損傷十分重要的3種酶[8]。其中，SOD作為細(xì)胞氧化防御體系中的第1道防線，被用作清除細(xì)胞中的氧自由基，催化超氧陰離子自由基(O2-)變成O2和H2O2。從圖3A可以看出，當(dāng)氧化鐵納米粒子的濃度為2.0×10-6和5.0×10-6mg/L時(shí)，SOD活性都比對(duì)照組要高，并且最高時(shí)比對(duì)照組高30%左右。這說明在氧化鐵納米粒子存在下，玉米體內(nèi)有大量的O2-存在，使得SOD活性增強(qiáng)。然而，當(dāng)氧化鐵納米粒子濃度達(dá)到1.0×10-5mg/L時(shí)，其SOD活性快速下降。這是由于O2-在體內(nèi)大量積累而產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，致使其活性降低。此外，CAT與POD作為細(xì)胞氧化防御體系中的第2道防線同樣起著重要的作用。它們能把生成的H2O2轉(zhuǎn)變成H2O和O2。一般來說，當(dāng)H2O2在體內(nèi)積累時(shí)，CAT與POD的活性會(huì)增加[9]。從圖3B可以看出，當(dāng)化鐵納米粒子的濃度為2.0×10-6mg/L時(shí)，CAT活性最高，而隨著濃度的增加，其活性急劇下降。圖3C可以看出，POD活性剛開始時(shí)就比對(duì)照低，并且隨著濃度的增加，其POD活性快速降低。這可能是由于玉米在高濃度的氧化鐵納米粒子的刺激下發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而刺激玉米自身的保護(hù)機(jī)制，導(dǎo)致整個(gè)機(jī)體都在協(xié)同抗擊氧化，使得相關(guān)的酶自身活性降低。

2.2MDA含量MDA是植物在受到外界脅迫時(shí)膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物。它的含量在一定程度上能反映植物膜對(duì)外界的抵抗能力。從圖4可以看出，用氧化鐵納米粒子處

圖4 不同濃度氧化鐵納米粒子所對(duì)應(yīng)玉米中丙二醛的含量

注：A.玉米根的表皮在紫外光激發(fā)下的熒光切片圖；C.玉米根在紫外光激發(fā)下的橫切熒光切片圖；E.玉米根的透射電鏡切片圖。圖B、D和F分別是圖A、C和E方框處的擴(kuò)大圖。圖5 切片圖

理的玉米葉中MDA含量都比不用氧化鐵納米粒子處理的對(duì)照組少。這進(jìn)一步驗(yàn)證了上面的推斷。這是由于當(dāng)玉米在受到外界脅迫而導(dǎo)致氧化損傷時(shí)，整個(gè)機(jī)體的抗氧化預(yù)防能力增強(qiáng)，從而減少體內(nèi)氧自由基的積累，導(dǎo)致膜脂過氧化作用的減少，使得體內(nèi)的MDA含量降低。

2.3玉米根切片為了研究氧化鐵納米粒子對(duì)玉米這些生理效應(yīng)的影響究竟是由氧化鐵納米粒子本身還是其進(jìn)入植物體內(nèi)后轉(zhuǎn)化為離子或其他物質(zhì)造成的，十分有必要弄明白氧化鐵納米粒子是否能進(jìn)入植物體內(nèi)及其在植物體內(nèi)的運(yùn)輸途徑。被熒光分子修飾了的氧化鐵納米粒子在紫外光激發(fā)下顯青色，而玉米自身則顯藍(lán)色。因此，從玉米根的表皮切片圖5A和5B可以看出，大量的熒光氧化鐵納米粒子存在于細(xì)胞壁的間隙中，而從其根的橫切切片圖5C、5D分析可得熒光氧化鐵納米粒子在進(jìn)入玉米根后主要分布在細(xì)胞間隙。這表明氧化鐵納米粒子能夠進(jìn)入玉米根里面，同時(shí)從上皮層運(yùn)輸?shù)狡べ|(zhì)層主要是通過質(zhì)外體途徑[10]。此外，玉米根的透射電鏡切片圖被用來驗(yàn)證氧化鐵納米粒子能進(jìn)入玉米體內(nèi)。從圖5F可以看出，黑點(diǎn)的尺寸約20 nm。這和氧化鐵納米粒子的大小基本相同，因此可以判斷這些黑點(diǎn)就是氧化鐵納米粒子[11]。由此可知，氧化鐵納米粒子已進(jìn)入玉米細(xì)胞體內(nèi)，并且存在于細(xì)胞質(zhì)里面。這證明氧化鐵納米粒子能進(jìn)入玉米細(xì)胞體內(nèi)。

3 小結(jié)與討論

該研究主要介紹了氧化鐵納米粒子對(duì)玉米生理效應(yīng)的影響，通過CAT、SOD與POD所組成的抗氧化酶體系的酶活性和MDA含量的變化來評(píng)估。CAT、SOD與POD酶活性以及MDA含量的變化表明，當(dāng)玉米在受到氧化鐵納米粒子脅迫時(shí)，玉米會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，但這會(huì)激發(fā)玉米自身的的保護(hù)機(jī)制，導(dǎo)致整個(gè)機(jī)體的抗氧化預(yù)防能力增強(qiáng)，使得機(jī)體的超氧陰離子自由基含量降低，減少對(duì)機(jī)體的損害。由此可知，氧化鐵納米粒子對(duì)玉米這種植物存在某種程度上的生物適應(yīng)能力。同時(shí)，氧化鐵納米粒子在玉米根內(nèi)從上皮層運(yùn)輸?shù)狡べ|(zhì)層主要通過質(zhì)外體途徑，并且能夠進(jìn)入玉米細(xì)胞中。這為進(jìn)一步評(píng)估納米氧化鐵對(duì)植物的影響奠定基礎(chǔ)。

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