馮華鄭佳柳寧

（岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物醫(yī)藥系， 湖南 岳陽 414000）

不同破壁法對金銀花中揮發(fā)油和綠原酸得率的影響

馮華鄭佳柳寧

（岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物醫(yī)藥系， 湖南 岳陽 414000）

目的 探討不同的破壁方法對金銀花中揮發(fā)油和綠原酸提取的影響。方法 采取溫差破壁技術(shù)、酶法破壁、低溫超音速氣流破壁技術(shù)和低溫高頻振動破壁技術(shù)，以破壁率、揮發(fā)油和綠原酸的得率作為評價指標，篩選最佳破壁方法;比較最佳破壁方法提取揮發(fā)油和綠原酸與傳統(tǒng)不破壁水提技術(shù)的提取效果。結(jié)果 經(jīng)過低溫高頻振動破壁后金銀花的破壁率以及揮發(fā)油和綠原酸的得率最高；且與傳統(tǒng)不破壁水提相比，揮發(fā)油得率提高了3倍，綠原酸提高將近1倍。結(jié)論 植物破壁技術(shù)的應(yīng)用，極大的提高了金銀花資源的利用率，所得產(chǎn)品質(zhì)量好。

金銀花；破壁；揮發(fā)油；綠原酸

金銀花（Lonicera japonica Thunb.），忍冬科多年生常綠纏繞灌木，氣芬郁而味甘，是我國常用中藥材、特有的天然產(chǎn)品和戰(zhàn)略性生物化工資源[1]。金銀花加工業(yè)是我國具有資源優(yōu)勢的特色生物產(chǎn)業(yè)，我國金銀花產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量95%[2]。金銀花芳香油和綠原酸是從金銀花中提取分離得到的，是在健康相關(guān)產(chǎn)品（食品、藥品、化妝品、日用品）中應(yīng)用十分廣泛的兩種生物活性成分[3]。

金銀花有效成分的分離提取興起于20世紀90年代，一般采用傳統(tǒng)水煮提取工藝或乙醇多次提取后再經(jīng)過各種除雜技術(shù)，其提取分離技術(shù)時間長、有效成分提取不充分且易被破壞、消耗大量的原料和能量、污染環(huán)境。近年來，植物破壁技術(shù)發(fā)展迅速，破壁后有效成分能夠直接溶出而提高了提取率[4]。植物破壁技術(shù)正逐漸從實驗室研究向規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用轉(zhuǎn)化。目前，技術(shù)成熟且已在規(guī)模生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的植物破壁技術(shù)主要有溫差破壁技術(shù)、酶法破壁、低溫超音速氣流破壁技術(shù)和低溫高頻振動破壁技術(shù)[5]。本研究以金銀花為原料，采用不同破壁方式處理，通過分析優(yōu)化出最佳的金銀花破壁方法，為金銀花資源深度利用和開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 試劑與儀器

金銀花（湖南如虹制藥有限公司提供，經(jīng)鑒定為忍冬科植物忍冬的初開的花），纖維素酶，果膠酶，木聚糖酶，無水乙醇，乙酸乙酯。

高效液相色譜儀CK-50（上海美資達科技有限公司），氣相色譜儀LCHG-08（河南信陽計量儀器公司），高頻振動破壁粉碎機SW-60B(大連機械設(shè)備集團)，超音速氣流粉碎機WQL（常州海涵干燥設(shè)備科技有限公司），超聲波儀TLMNZ09（南京中旭電子科技有限公司），高速離心機S7-21(上海精科制造有限公司)，顯微鏡CX40型（日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)公司）。

2 方法

2.1 破壁超聲波提取金銀花中有效成分的工藝流程

2.1.1 金銀花鮮花經(jīng)各種方法破壁。

2.1.2 加5倍量水，在300W超聲波作用下，常溫浸提50min。

2.1.3 冷藏靜置24h。

2.1.4 浸提液高速離心（3000r/min以上），分離油水混合液。得到金銀花粗油和金銀花水提液。

2.1.5 金銀花粗油進行分子蒸餾，得到金銀花精油；金銀花水提液，加HCL調(diào)pH，乙酸乙酯萃取，活性炭脫色，過濾，濾液濃縮干燥得到淡黃色綠原酸。

2.2 金銀花破壁實驗方法

2.2.1 溫差破壁法 將金銀花放入研缽，研碎后將其置于-l0℃的冰箱內(nèi)存放24h后，迅速加入80%的熱水(比例為5g：1mL），大致可使金銀花浸濕攪拌，然后迅速冷卻至40～45℃，并在恒溫45℃連續(xù)攪拌6h。

2.2.2 酶法破壁 將金銀花研磨后加水，配成20%的金銀花溶液。再添加纖維素酶和果膠酶各0.2%(質(zhì)量分數(shù))。反應(yīng)溫度維持在40～45℃，間歇攪拌5h。然后在反應(yīng)液中添加0.2%(質(zhì)量分數(shù))的蛋白酶，繼續(xù)攪拌5h，加熱使酶失活，可得破壁金銀花混合液。

2.2.3 低溫超音速氣流破壁 超音速氣流粉碎機開機預(yù)冷至-20℃，然后將金銀花破壁粉碎至5～50μm，待用。

2.2.4 低溫高頻振動破壁 高頻振動破壁粉碎機開機預(yù)冷至-20℃，然后將金銀花破壁粉碎至5～50μm，待用。

2.3 用血球計數(shù)板計算各種破壁方法的破壁率

顯微鏡下破壁率的計算：取0.50g破壁金銀花樣品，用純水稀釋，定容至25.00mL，混勻，制薄片，各重復(fù)片3張。生物顯微鏡下隨機觀察100個視野，計算已破壁和未破壁的細胞數(shù)，其中已破壁的細胞數(shù)占觀察的總細胞數(shù)的百分數(shù)即為花粉的破壁率[6]。

計算公式：破壁率/%=已破壁金銀花粒數(shù)／觀察金銀花細胞總粒數(shù)×100%

2.4 揮發(fā)油和綠原酸的含量測定

揮發(fā)油的含量測定采用金銀花揮發(fā)油稱重法，綠原酸的含量測定采用HPLC（CHP2010版附錄ⅥD）進行測定。

3 結(jié)果及分析

3.1 金銀花破壁前后細胞形態(tài)比較

金銀花破壁前后細胞形態(tài)比較見圖1。

圖1 金銀花破壁前后細胞圖

3.2 揮發(fā)油含量測定

金銀花粗油經(jīng)分子蒸餾后稱重，然后計算揮發(fā)油的得率。并且本研究對金銀花中的揮發(fā)油進行初步的氣相色譜確定，經(jīng)分析鑒定中健欣元生物科技有限公司栽培的金銀花揮發(fā)油主要成分為：芳樟醇、a一萜品醇、環(huán)氧芳樟醇、順芷酸一3一已烯酯、順一3一已烯醇、對甲氧基苯甲醛、順一菜莉酮等成分[7]。檢測結(jié)果見圖2。

圖2 金銀花揮發(fā)油氣相圖譜

3.3 綠原酸含量測定

色譜條件色譜柱為國產(chǎn)KromasilC18柱（250mm×4.6mm，7μm）；柱溫25℃；流動相為乙腈-0.4%磷酸（12∶88）；流速為1mL·min-1；檢測波長327nm。其檢測結(jié)果見圖3。

圖3 破壁金銀花的色譜圖

3.4 不同破壁方法結(jié)果比較

不同的破壁方法（不破壁、溫差破壁、酶法破壁、低溫超音速氣流破壁、低溫高頻振動破壁）對金銀花的破壁率以及金銀花的揮發(fā)油和綠原酸的得率的影響。其結(jié)果見表1。

表1 不同破壁方法結(jié)果比較

由表1可以看出，低溫高頻振動破壁法的破壁率最高，高達85.4%?？傏厔萆险f破壁率越高，金銀花中有效物質(zhì)溶出量越高。但是溫差破壁法由于有加熱這一過程造成揮發(fā)油的得率大大降低。低溫超音速氣流破壁技術(shù)難以粉碎纖維性、韌性中藥材，適合含水量不高于4%的十分干燥的物料進行破壁粉碎，而且在粉碎作用時存在相對高速氣流，可將藥物的揮發(fā)性成分帶走，造成藥效損失。低溫高頻振動破壁粉碎技術(shù)是利用球形或棒形磨介作高頻振動而產(chǎn)生的沖擊、摩擦、剪切等作用力來實現(xiàn)對物料的破壁粉碎。振動磨用彈簧支撐磨機體，由一帶有偏心塊的主軸使其振動，磨機通常是圓柱形或槽形，振動磨的效率比普通磨高10-20倍，其粉磨速度比常規(guī)球磨機快得多，而且能耗低數(shù)倍，細胞破壁提取實際是一個生物活性成分在破壁后的直接溶出過程，因而，提取條件溫和、溶媒少、提取速度快、資源利用率高、提取成品質(zhì)量好。

表2 傳統(tǒng)不破壁水提技術(shù)和破壁超聲提取技術(shù)比較

3.5 破壁超聲波提取與傳統(tǒng)不破壁水提技術(shù)提取兩種方法的比較結(jié)果

在正交試驗確定的破壁后超聲浸提最佳工藝的條件下[8]，提取和分離揮發(fā)油和綠原酸，相比傳統(tǒng)不破壁水提工藝，揮發(fā)油得率為0.481%，比傳統(tǒng)煎煮法提高了3倍，綠原酸得率為5.31%，比較結(jié)果見表2。比傳統(tǒng)煎煮法提高將近1倍。同時耗時耗能均有所降低。

4 結(jié)論

通過采用不同破壁方法的同時制備金銀花中揮發(fā)油和綠原酸，得出經(jīng)低溫高頻振動破壁后的金銀花破壁率最高，揮發(fā)油和綠原酸得率也最高。在正交實驗確定的最佳工藝參數(shù)下提取揮發(fā)油和綠原酸，揮發(fā)油得率為0.481%，比傳統(tǒng)不破壁水提技術(shù)提高了3倍，綠原酸得率為5.31%，比傳統(tǒng)不破壁水提技術(shù)提高將近1倍。金銀花經(jīng)低溫高頻振動破壁后再同時提取揮發(fā)油和綠原酸，具有以下優(yōu)點：

4.1 工藝更科學(xué)、合理

金銀花中綠原酸的提取現(xiàn)有技術(shù)多采用乙醇多次提取后再經(jīng)過各種除雜技術(shù)提純綠原酸；金銀花精油的制備多采用水蒸氣蒸餾后有機溶劑再萃取，精油得率低。金銀花中含有許多熱敏性的物質(zhì)，在高溫蒸餾或煎煮的作用下會被破壞，而且多數(shù)不揮發(fā)的功能物質(zhì)留在母液中被丟棄，造成金銀花固有成分缺失，藥用成分破壞較嚴重[9]。金銀花采用破壁和超聲浸提，提取條件溫和，純化工藝更合理，極大限度提取其中有效成分的同時，有效保護了其中生物活性成分。

4.2 資源利用充分

金銀花作為一種中藥，其組成十分復(fù)雜，主要以綠原酸、木樨苷、黃酮類物質(zhì)為代表。《中國藥典》以金銀花中的綠原酸作為金銀花的表征物質(zhì)，是金銀花的主要功效物質(zhì)[10]；金銀花的花香氣味主要來源于其低沸點的揮發(fā)性組分，通過分子蒸餾可獲得高純度的芳香精油。本發(fā)明最大限度利用了資源，從中藥資源保護角度上具有重要的意義。

4.3 低能耗、環(huán)保節(jié)能

傳統(tǒng)提取工藝需要高溫高壓、大量溶媒、反復(fù)提取，生產(chǎn)工藝能源消耗大、污染環(huán)境。而本工藝只采用低溫高頻振動粉碎破壁技術(shù)超聲水提，溶媒少、提取速度快、耗能少，無有害溶劑、節(jié)約能源、保護了環(huán)境

4.4 質(zhì)量優(yōu)勢

金銀花采用先進的破壁超聲提取得到的綠原酸和精油2種產(chǎn)品，極大限度地提高了金銀花中有效成分的利用率，利用先進的HPLC方法對其有效成分進行檢測，綠原酸的得率達95%以上；精油為淺黃色液體，主要化學(xué)成分如芳樟醇、萜品醇、環(huán)氧芳樟醇、香葉醇各種指標都達到了文獻標準。從而保證了產(chǎn)品的質(zhì)量和療效。

本研究組采用植物破壁技術(shù)，配超聲波提取、超濾、萃取、分子蒸餾等手段，同時制備出具有高附加值金銀花有效成分產(chǎn)品綠原酸和揮發(fā)油，極大的提高金銀花資源的利用率，提取效率高，所得產(chǎn)品品質(zhì)好。

[1]賈文杰.金銀花研究進展[J].吉林農(nóng)業(yè)，2012(8)：223-224

[2]張守平，辛寧，王柳萍.金銀花化學(xué)成分及質(zhì)量控制研究進展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14(3)：84-86.

[3]陳曉麟.金銀花研究概況[J].重慶教育學(xué)院學(xué)報，2007，20 （6）：15-18.

[4]唐維，張星海．花粉破壁方法的研究進展[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29(2)：86-92．

[5]包秀萍，郭麗梅，劉敏，等.花粉破壁方法的研究[J].杭州化工，2009，39(4)：26-28．

[6]楊義雄，王宮.多酶體破壁提取蜂花粉中活性蛋白的工藝研究[J].福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，19(3)：24-26.

[7]張軍，趙光莉，莊桂東，等.SFE-MD技術(shù)分離提純金銀花揮發(fā)油及其成分分析[J].精細化工，2008，25（1）：49-53.

[8]張曉東，潘國鳳，呂圭源.超聲提取在中藥化學(xué)成分提取中的應(yīng)用研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥，2004，15(12)：861-862．

[9]楊金平，嚴軍，曲永勝，等.金銀花產(chǎn)銷趨勢分析[J].中國現(xiàn)代中藥，2003，15(8)：704-706.

[10]劉鋼，張平，夏泉.正交試驗法優(yōu)選金銀花的提取工藝研究[J].海峽藥學(xué)，2012，24(8)：17-19.

（責任編校：馬余平）

Effects of Wall-broken Methods on Yield of Volatile Oil and Chlorogenic Acid of Lonicera Japonica Thunb

FENG Hua ZHENG Jia LIU Ning

(Biological Medicine Department,Yueyang Vocational and Technical College,Yueyang，Hunan 414000)

Objective：To investigate the effects of Wall-broken methods on Yield of volatile oil and chlorogenic acid of Lonicera Japonica Thunb.Method：Screening of the best extraction method being based on temperature difference between the wall technology,breaking by enzyme,low temperature supersonic airflow wall technology and low frequency vibration broken technology,and using the broken rate and the yield of the volatile oil and chlorogenic acid as index to compare the effect of extraction of the Wall-breaking methods and the Wall-unbroken water extraction technology.Result：The method to get the highest broken rate and the yield of the volatile oil and chlorogenic acid is using the technology of low frequency vibration wall-broken. compared with Wall-unbroken water extraction technology,the yield of the volatile oil increase 3 times and chlorogenic acid increase nearly1 time.Conclusion:The technology of Wall-broken greatly improve the utilization rate of resources of Lonicera japonica Thunb.

Lonicera Japonica Thunb;Wall-broken;volatile oil;chlorogenic acid

R 282.710.2

A

1672－738X（2014）01－0077－05

2013-10-31

岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院2011年重點項目（YZ1101M）。

馮華（1983—），女，湖南岳陽人，藥學(xué)講師，生物化學(xué)與分子生物學(xué)碩士。主要研究方向：中藥新藥開發(fā)研究。