王小敏 葉曉霞 龍海桂

（玉林師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 廣西 玉林 537000）

羅漢果莖段快繁技術(shù)研究

王小敏 葉曉霞 龍海桂

（玉林師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 廣西 玉林 537000）

為了獲得高質(zhì)量的羅漢果組培苗，本文主要探究羅漢果從外植體誘導(dǎo)到幼苗移栽的整個(gè)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：外植體消毒的最佳方法為10%過(guò)氧化氫，消毒3min，污染率最低，而外植體成活率高達(dá)80%。MS+IBA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L和MS+IBA0.5mg/L+6-BA1.5mg/L有利于羅漢果的增殖，其增殖系數(shù)達(dá)4.45，1/2MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L最適合羅漢果根的分化。移栽初期有光照并經(jīng)過(guò)煉苗的移栽方法成活率最高，幼苗移栽成活率在80%以上。

羅漢果；叢生芽；增殖；組織培養(yǎng)

羅漢果(Grosvenor Momordica)是葫蘆科羅漢果屬的多年生藤本藥用植物，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品、食品領(lǐng)域。羅漢果對(duì)生境的要求較為嚴(yán)格，為我國(guó)特有珍貴藥材。廣西永福、臨桂兩縣為羅漢果的栽培起源中心，而且由于該地獨(dú)特的土壤環(huán)境和氣候特點(diǎn)，所產(chǎn)的羅漢果品質(zhì)優(yōu)良，具有較好的保健和療效，在東南亞、日本、歐美等國(guó)家譽(yù)為“東方神果”。羅漢果含有豐富的果糖、蛋白質(zhì)、氨基酸類、脂肪酸類和多種維生素等眾多成分，其中羅漢果甜甙是主要成分，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值高[1]，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上越來(lái)越多的羅漢果產(chǎn)品被競(jìng)相開(kāi)發(fā)，對(duì)羅漢果的需求也急劇增長(zhǎng)[2]。羅漢果以種植雌株為主，而種子繁殖后代中雄株比例偏高，所以在傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式中主要利用雌株壓蔓的方式生產(chǎn)種苗，繁殖系數(shù)低，且易患病毒病，難以滿足生產(chǎn)的需要。利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖羅漢果種苗，不僅可以加速品種繁育，而且能在一定程度上保持母本的優(yōu)良性狀。羅漢果組培苗具有種苗不帶病毒、繁殖系數(shù)高、當(dāng)年掛果、產(chǎn)量高、不受季節(jié)和氣候條件影響的優(yōu)勢(shì)，所繁殖的組培苗能滿足生產(chǎn)的大量需求[3]。目前生產(chǎn)上主要通過(guò)種植脫毒組培苗來(lái)減少種性退化和病毒病問(wèn)題，但也出現(xiàn)一些問(wèn)題，包括組培苗成活率低、遺傳性狀不夠穩(wěn)定等[3-4]。為了實(shí)施組培苗標(biāo)準(zhǔn)化工程，規(guī)范種苗市場(chǎng)，適應(yīng)羅漢果規(guī)范化生產(chǎn)要求，本文試對(duì)羅漢果從外植體誘導(dǎo)到幼苗移栽的整個(gè)過(guò)程進(jìn)行研究，以期為羅漢果種苗的標(biāo)準(zhǔn)化和市場(chǎng)的規(guī)范化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

外植體取自廣西永福縣健康無(wú)病毒、掛果率高的羅漢果植株。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒試驗(yàn)

將選取的莖段在超凈工作臺(tái)上用75%酒精預(yù)消毒30s，用無(wú)菌水沖洗3次，然后分別用0.1%升汞（HgCl2）消毒液和10%過(guò)氧化氫（H2O2）分別消毒時(shí)間為3、5、7min，并用無(wú)菌水分別沖洗5次。然后接入MS+6BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度為2500lx,培養(yǎng)10d后調(diào)查外植體污染情況。

1.2.2 6-BA濃度對(duì)羅漢果增殖效果的影響試驗(yàn)

將無(wú)菌苗3～5cm腋芽切割后分別接種在MS+ IBA0.5mg/L+6-BA（0.3、0.5、1.0、1.5、2.0）mg/L各種培養(yǎng)基上，各種培養(yǎng)基均添加蔗糖30g/L、瓊脂5 g/L，調(diào)pH至5.8～6.0，每種培養(yǎng)基接5瓶，每瓶接4個(gè)莖段進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度為2500lx，30d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的增殖率及芽的生長(zhǎng)情況。

1.2.3 生長(zhǎng)素濃度對(duì)羅漢果根分化的影響試驗(yàn)

將分化獲得的3～5cm腋芽切割后分別接種在：MS+6-BA1.0mg/L+IBA（0.2、0.4、0.5、0.6）mg/L培養(yǎng)基上，各種培養(yǎng)基均添加蔗糖30g/L、瓊脂5 g/L，調(diào)PH至5.8～6.0。每種接5瓶，每瓶接4個(gè)莖段進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25±1℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度為2500lx，30d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的誘導(dǎo)率及芽的生長(zhǎng)情況。

1.2.4 羅漢果移栽試驗(yàn)

將生根良好健壯的幼苗培養(yǎng)瓶分成兩組，一組幼苗拿到室外進(jìn)行煉苗，在散射光條件下培養(yǎng)5d，使培養(yǎng)瓶中幼苗適應(yīng)外部環(huán)境然后移栽。另一組作為對(duì)照，直接從瓶中取出幼苗，洗去基部培養(yǎng)基進(jìn)行移栽。移栽基質(zhì)為珍珠巖和泥炭土按體積比1：1混合，并經(jīng)高溫滅菌。移栽后，將煉苗的和未煉苗的小苗各分成2組，一組初期蓋上遮陽(yáng)網(wǎng)，連續(xù)蓋10d后才移除，另一組除了地膜不用遮陽(yáng)網(wǎng)遮蓋，以利于其進(jìn)行光合作用。在幼苗生長(zhǎng)期間，兩組幼苗要提供相同的水熱肥氣等培養(yǎng)條件，以防其他因素干擾試驗(yàn)結(jié)果。每組苗移栽10棵，20d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果用dps7.05軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同表面消毒劑處理對(duì)羅漢果莖段滅菌及成活率的影響

用不同表面消毒劑處理接種，20d后統(tǒng)計(jì)莖段污染率及成活率，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)：0.1%升汞和10%過(guò)氧化氫對(duì)外植體滅菌效果都很明顯，但對(duì)發(fā)芽率有明顯影響。用0.1%升汞處理的莖段污染率基本控制在10%以下，說(shuō)明滅菌效果較好，但成活率隨滅菌時(shí)間延長(zhǎng)而顯著下降，最高成活率在處理3min時(shí)，達(dá)到60%。用10%過(guò)氧化氫處理的莖段污染率也控制在10%以下，成活率較升汞有明顯提高，在處理3min時(shí)的成活率達(dá)到76.7%，效果較好。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)羅漢果種子萌發(fā)率影響

2.2 不同6-BA濃度對(duì)羅漢果增殖效果的影響

在羅漢果叢生芽增殖階段，采用MS+ IBA0.5mg/L的培養(yǎng)基添加不同濃度6-BA研究叢生芽增殖的情況，培養(yǎng)20d進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（結(jié)果見(jiàn)表2）。由表2得知：不同6-BA濃度對(duì)羅漢果增殖效果有明顯的影響。在一定范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的升高，增殖系數(shù)也隨之增高，當(dāng)達(dá)到最大值后，6-BA會(huì)抑制芽的增殖。增殖效果最好的6-BA濃度為 1.5mg/L，增殖系數(shù)達(dá)到 4.45，其次為1.0mg/L，增殖系數(shù)為4.2，在平均芽長(zhǎng)和平均直徑上都與其處理?xiàng)l件達(dá)到極顯著的差異。而且在這兩個(gè)濃度下，叢生芽葉片顏色及長(zhǎng)勢(shì)都較好，平均芽長(zhǎng)、平均芽直徑都比其他濃度6-BA生長(zhǎng)下的叢生芽好。因此羅漢果增殖適宜培養(yǎng)基為MS+ IBA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L和MS+IBA0.5mg/L+6-BA1.5mg/L。

2.3 不同生長(zhǎng)素濃度對(duì)羅漢果根分化影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

當(dāng)分化的芽長(zhǎng)至約4cm時(shí)，將芽接入生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)根生長(zhǎng)狀況。生根培養(yǎng)基采用

1/2MS+6-BA1.0mg/L附件不同濃度的IBA（結(jié)果見(jiàn)表3）。結(jié)果表明：IBA對(duì)生根影響明顯，隨著IBA濃度的升高，生根率隨之增高，同時(shí)根生長(zhǎng)狀況也逐漸變好，當(dāng)IBA濃度達(dá)到0.5mg/L時(shí)，生根率達(dá)到最高，為50%，而且根多、粗壯，在平均根長(zhǎng)、平均根直徑上都與其他處理達(dá)到了極顯著差異。當(dāng)IBA濃度達(dá)到0.6mg/L時(shí)，生根率下降。因此，適宜羅漢果生根的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L。

表2 不同6-BA濃度對(duì)羅漢果增殖效果的影響

表3 不同生長(zhǎng)素濃度對(duì)羅漢果根分化影響

2.4 光照及煉苗對(duì)羅漢果移栽成活率的影響

在羅漢果組培苗移栽階段，煉苗、光照處理對(duì)組培苗移栽成活率影響較大，結(jié)果見(jiàn)表4。表4結(jié)果表明：在移栽初期，在避光條件下，移栽組培苗成活率較低，最高成活率只有10%，而光照條件下，組培苗移栽成活率達(dá)到80%。同時(shí)，煉苗也對(duì)移栽成活率影響明顯，在避光條件下，煉苗處理后，組培苗移栽成活率達(dá)到10%，不煉苗的一組全部不能成活。而在光照條件下，煉苗處理后，組培苗成活率達(dá)到80%，不煉苗處理的組培苗成活率僅為30%。

表4 移栽初期不同處理方法對(duì)羅漢果成活率的影響

3 結(jié)果與討論

羅漢果的組織培養(yǎng)研究始于1980年[5]，經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，組培苗生產(chǎn)技術(shù)日趨成熟。然而，不同公司或批次的苗木存在著定植成活率、開(kāi)花結(jié)果株率等方面的不穩(wěn)定性，造成了不同程度的經(jīng)濟(jì)損失，增加了種植風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)羅漢果組織培養(yǎng)研究，摸索更有利于組培苗生產(chǎn)的全過(guò)程仍具有較強(qiáng)的實(shí)際指導(dǎo)意義。

在外植體選擇方面，選擇健康、掛果率高的優(yōu)良品種是保證組培苗生產(chǎn)的重要前提[6-7]。本課題組選擇羅漢果原產(chǎn)地桂林永福優(yōu)良的羅漢果品系莖段作為外植體，保證了種源的可靠性。

細(xì)胞分裂素對(duì)細(xì)胞的分裂增殖起著重要的調(diào)節(jié)作用[8]。本研究結(jié)果也顯示，隨著細(xì)胞分裂素6-BA濃度的增加，叢生芽增殖率也逐步提高，適宜的6-BA濃度為1.0-1.5mg/L，考慮到生產(chǎn)成本的因素，最適宜的濃度選擇為1.0mg/L。很多的研究表明生長(zhǎng)素濃度對(duì)組培苗生根影響明顯，但不同的研究表明在生根階段所使用的激素種類和濃度卻有所差異[9-11]。本研究表明，IBA濃度為0.5mg/L時(shí)，羅漢果生根較好，生根率和根生長(zhǎng)狀況都良好，能夠滿足生產(chǎn)需要。

提高移栽成活率是組培苗工廠化生產(chǎn)的最后環(huán)節(jié)。羅漢果是一種喜光而不耐強(qiáng)光的植物[12]，因此光照對(duì)于羅漢果影響較大。本研究結(jié)果表明煉苗與光照對(duì)羅漢果的移栽成活率較大，經(jīng)過(guò)煉苗處理與移栽初期進(jìn)行光照培養(yǎng)，移栽成活率可達(dá)80%，可能與光照可幫助幼苗進(jìn)行光合作用，吸收養(yǎng)分，促進(jìn)根的固定化有關(guān)。

4 結(jié)語(yǔ)

羅漢果是我國(guó)特有的中藥材，提高羅漢果組培苗的產(chǎn)量和質(zhì)量將為推廣和種植羅漢果奠定基礎(chǔ)。影響羅漢果組培苗生長(zhǎng)因素很多，本文從影響羅漢果組培苗生長(zhǎng)的幾個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行研究，為羅漢果組培苗規(guī)范化生產(chǎn)及組培快繁體系奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編校：馬余平）

Study on the Rapid Propagation Technology of Siraitia Grosvenorii Stem

WANG Xiao-min YE Xiao-xia LONG Hai-gui

(College of Life Science and Technology,Yulin Normal College,Yulin,Guangxi 537000)

The research aimed to obtain high-quality tissue culture seedlings of Siraitia Grosvenorii.This research had mainly explored the whole process of Siraitia Grosvenorii from explant inducement to transplanting seedlings.The results showed that:The best way of sterilizing was obtained after 3 minutes surface disinfection Siraitia Grosvenorii explant in (10%)H2O2 solution and the highest explants survival rates reached 80%.The mediums of MS+IBA0.5+6-BA1.0 mg/L and MS+IBA 0.5 mg/L+6-BA 1.5 mg/L were propitious to the propagation of bud clusters and multiplication coefficient was more than 4.45.The medium of 1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L was suitable for the differentiation of Siraitia Grosvenorii.root.At the early stage after transplanting,the seedling of survival rate was highest with illuminating and seedling adaptation,and the survival rate of transferred plantlets was up to 80%.

Siraitia Grosvenorii.;clustered buds;proliferation;tissue culture

S 567

A

1672－738X（2014）01－0069－04

2014-01-02

2012年廣西自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目 （2012GXNSFBA053076）和2013年玉林師范學(xué)院校級(jí)博士啟動(dòng)基金（G20130013）。

王小敏（1979—），男，廣西全州人，生物講師，理學(xué)博士。主要研究方向：植株細(xì)胞工程與基因工程。