付換成盧秋麗劉浩張文秋趙云

重組抗人表皮生長因子受體（EGFR）嵌合單克隆抗體CH225非還原電泳純度分析

付換成①盧秋麗①劉浩②張文秋③趙云①

目的：分析CH225在非還原電泳時抗體條帶主條帶以外在高分子量和低分子量產生雜條帶的原因。方法：在不同的供試品緩沖液和不同電泳條件下進行SDS-PAGE電泳比較。結果：上樣前100 ℃煮樣1 min與加碘乙酰胺結果相同。結論：高分子量和低分子量雜條帶可以用電泳上樣前100 ℃煮樣1 min消除即可。

非還原SDS-PAGE； 重組單抗； EGFR； 重組抗人表皮生長因子受體

藥品生產過程中，重組蛋白類藥物的質量檢測和控制十分重要，SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）是蛋白類藥物的純度分析的常用手段[1-2]。CH225（重組抗人表皮生長因子受體（EGFR）嵌合單克隆抗體）是四川恒星生物制藥有限公司采用基因工程技術，利用NS/0細胞表達的人源化抗體，屬于IgG1亞型，已用于轉移性結直腸癌、頭頸癌等多種癌癥的治療，并且現(xiàn)有研究表明可能適用于鼻咽癌、肺癌等其他癌癥的治療[3-4]。在CH225的臨床前研發(fā)，質量檢測的過程中發(fā)現(xiàn)，除抗體主條帶以外，還存在一些分子量大小不同的雜條帶，特別在非還原性實驗中，情況尤為明顯。本文采用不同溫度和不同試劑的條件下對樣品進行預處理，比較最佳的SDS-PAGE結果，為CH225批量生產的質量檢測和控制提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品 參比品（批號C201105002）：四川恒星生物制藥有限公司于2011年5月第2批生產的CH225注射液；對照品（批號C201107006）：四川恒星生物制藥有限公司于2011年7月第6批生產的CH225注射液；愛比妥（Erbitux）：通用名西妥昔單抗（cetuximab），默克公司生產。

1.2 主要試劑和儀器 SDS-PAGE電泳裝置和掃描儀為Bio-Rad公司產品；水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 緩沖液的配制 還原型SDS-PAGE供試品緩沖液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚藍，4% SDS，200 mmol/L DTT；非還原型SDS-PAGE供試品緩沖液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚藍，4% SDS；天然供試品緩沖液（2×）：0.12 mol/L Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚藍；加碘乙酰胺的非還原SDS-PAGE供試品緩沖液（2×）：向上述非還原SDS-PAGE供試品緩沖液中加入新鮮配制的1 mol/L碘乙酰胺母液，至終濃度為200 mmol/L。

1.4 實驗過程

1.4.1 70 ℃與100 ℃水浴非還原SDS-PAGE分析C201105002（參比品）、稀釋至2 mg/mL與2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，70 ℃分別水浴1、3、5 min后，立即轉入冰浴。另取相同樣品加入與2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，100 ℃分別水浴1、3、5 min，立即轉入冰浴。再取相同樣品加入2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，不經水浴。分離膠濃度8.0%，10 μL/孔上樣，100 V電壓開始電泳，待指示劑前沿進入分離膠后，電壓改為150 V。電泳結束后，凝膠用考馬斯亮藍R250染色[5]。

1.4.2 普通非還原SDS-PAGE與天然SDS-PAGE分析 C201105002（參比品）和Erbitux樣品均稀釋至2 mg/mL與2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，分別70 ℃水浴3 min、100 ℃水浴1 min后，立即轉入冰浴。分離膠濃度8.0%，10 μL/孔上樣，100 V開始電泳，待指示劑前沿進入分離膠后，電壓改為150 V。另取相同樣品加入天然供試品緩沖液后不進行加熱變性處理，直接進行SDS-PAGE電泳。再取相同樣品加入2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液等體積混合，不經水浴進行電泳。電泳結束后，凝膠用考馬斯亮藍R250染色[5]。

1.4.3 添加碘乙酰胺的非還原SDS-PAGE分析C201105002（參比品）、C201107006和Erbitux樣品均稀釋至2 mg/mL，分別加入2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液或加碘乙酰胺的2×非還原SDS-PAGE供試品緩沖液，混勻后，70 ℃水浴3 min。分離膠濃度8.0%，上樣量10 μL，采用室溫條件下150 V恒壓電泳。電泳結束后，SDS-PAGE凝膠用考馬斯亮藍R250染色[1]。

2 結果

2.1 70 ℃與100 ℃不同時間水浴非還原SDS-PAGE分析 70 ℃分別處理1、2、3 min的樣品電泳結果的相對分子量小的次帶依次減少，70 ℃ 3 min相對分子量小的次帶已基本不可見；100 ℃ 1、2、3 min時相對分子量小的次帶有增加趨勢，100 ℃ 1 min時相對分子質量小的次帶已基本消失；未經水浴的條帶出現(xiàn)多個雜的相對分子低的次帶。表明對樣品進行70 ℃ 3min或者100 ℃ 1 min的水浴處理對減少相對分子小的次帶有較好的效果，見圖1。

圖1 70 ℃與100 ℃不同時間水浴非還原SDS-PAGE

2.2 普通非還原SDS-PAGE與天然SDS-PAGE分析 未經水浴的樣品中相對分子量大和相對分子量小的雜條帶比較明顯；對樣品進行過預處理的電泳結果條帶單一；而對樣品未經預處理的天然SDS-PAGE電泳結果出現(xiàn)彌散狀條帶，見圖2。

圖2 普通非還原SDS-PAGE與天然SDS-PAGE

2.3 添加碘乙酰胺的非還原SDS-PAGE分析 愛比妥、C201107006、參比品在添加碘乙酰胺的情況下都比其沒有添加碘乙酰胺的相對分子量小的次帶要少得多；添加碘乙酰胺的樣品和未添加碘乙酰胺但經過100 ℃ 1 min水浴的樣品的相對分子量小的次帶都明顯減少；在70 ℃ 3min煮樣后再添加碘乙酰胺對減少相對分子量小的次帶基本沒有效果，見圖3。

圖3 添加碘乙酰胺與未添加碘乙酰胺的非還原SDS-PAGE

3 討論

由以上實驗，可推測，電泳中低分子量條帶可能由這些原因導致：在基因表達過程中，抗體分子內存在自由巰基，這些自由疏基因為無法形成完整的二硫鍵，輕鏈和重鏈之間只能由非共價鍵的作用力連接[6-7]；在電泳時樣品的加熱變性處理或未經處理的過程中（如圖2），輕鏈和重鏈之間的非共價鍵斷裂，因此而導致產生了一些游離的抗體分子亞基，從而出現(xiàn)了低相對分子質量條帶[8]；另外，在電泳時樣品的加熱變性處理的條件下，抗體分子的自由巰基還可能會引發(fā)二硫鍵重排，導致部分鏈間二硫鍵斷裂，增加低相對分子質量條帶出現(xiàn)的幾率[9-10]。

高分子量聚體帶產生的可能原因是，在加熱變性處理的過程中，抗體分子間的自由巰基通過縮合形成分子間二硫鍵，從而將單體的抗體分子連接成分子聚體，出現(xiàn)聚體帶[7-9]。碘乙酰胺可以保證蛋白質樣品完全變性并保持還原狀態(tài)，可以對蛋白質分子中的自由巰基進行封閉，以阻止二硫鍵重排的反應以及自由巰基重新形成二硫鍵，從而抑制電泳次帶的產生[8，11-12]。封閉自由巰基后的非還原SDS-PAGE結果顯示，如圖3中所示，高相對分子量的聚體帶基本消失，低相對分子量帶顯著減少，證明非還原SDS-PAGE結果中出現(xiàn)的次帶是在電泳樣品變性處理過程中因有自由巰基的存在而產生的。

綜上實驗結果，鑒于100 ℃煮樣1 min情況下，加不加碘乙酰胺對次帶形成影響不大，因此以后CH225項目質量檢測的SDS-PAGE實驗采用100 ℃煮樣1 min，不加碘乙酰胺的預處理方案。

[1]程立均，魏敬雙，張世雄，等.重組單抗藥物的非還原電泳純度分析[J].中國生物制品學雜志，2010，23（1）：83-86.

[2] Chan A T C，Hsu M M，Goh B C，et al.Multicenter，phase Ⅱ study of cetuximab in combination with carboplatin in patients with recurrent or metastatic nasopharyngeal carcinoma[J].Journal of clinical oncology，2005，23（15）：3568-3576.

[3] Borghaei H，Aggarwal C.Rational use of cetuximab in the treatment of advanced non-small cell lung cancer[J].Onco Targets and Therapy，2009（2）：251.

[4]郭堯君.蛋白質電泳實驗技術[M].北京：科學出版社，2005：1-5.

[5] Liu H，Gaza-Bulseco G，Chumsae C，et al.Characterization of lower molecular weight artifact bands of recombinant monoclonal IgG1 antibodies on non-reducing SDS-PAGE[J].Biotechnol Lett，2007，29 （11）：1611-1622.

[6] Zhang W，Czupryn M J.Free sulfhydryl in recombinant monoclonal antibodies[J].Biotechnol Progress，2002，18（3）：509-513.

[7] Taylor F R，Prentice H L，Garber E A，et al.Suppression of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis sample preparation artifacts for analysis of IgG4 half-antibody[J].Anal Biochem，2006，353（2）：204-208.

[8] Liu H，Gaza-Bulseco G，Chumsae C，et al.Characterization of lower molecular weight artifact bands of recombinant monoclonal IgG1 antibodies on non-reducing SDS-PAGE[J].Biotechnol Lett，2007，29 （11）：1611-1622.

[9] Liu H，May K.Disulfide bond structures of IgG molecules：structural variations，chemical modifications and possible impacts to stability and biological function[C].MAbs.Landes Bioscience，2012，4（1）：17.

[10] Zhang L，Chou C P，Moo-Young M.Disulfide bond formation and its impact on the biological activity and stability of recombinant therapeutic proteins produced by Escherichia coli expression system[J].Biotechnology Advances，2011，29（6）：923-929.

[11] Zhu Z C，Chen Y，Ackerman M S，et al.Investigation of monoclonal antibody fragmentation artifacts in non-reducing SDS-PAGE[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2013，33（83）：89-95.

Analysis of the Recombinant Monoclonal EGFR Antibody （CH225） on non-reducing SDS-PAGE

/FU Huan-cheng，LU Qiu-li，LIU Hao，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（15）：028-030

Objective：To analyze the non-Reduced SDS-PAGE purity of monoclonal antibody CH225 and the reason of the appearance of bands with a lower or a higher molecular weight.Method：The EGFR samples were treated with various loading buffers and various conditions for SDS-PAGE.Result：The result of incubation of 100℃ for 1 min appeared the same to the result with iodoacetamide added.Conclusion：The appearance of the bands with a lower or a higher molecular weight may be eliminated by incubation of 100 ℃ for 1 min for SDS-PAGE.

Non-Reduced SDS-PAGE； Recombinant monoclonal antibody； EGFR； Recombinant EGFR antibody

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.15.010

2014-03-03）（本文編輯：歐麗）

①四川大學生命科學學院 四川 成都 610064

②四川恒星生物制藥有限公司

③四川大學華西藥學院

趙云

First-author’s address：College of Life Science in Sichuan University，Chengdu 610064，China