孫元琳 崔 璨 顧小紅 陳尚衛(wèi) 宋 昱 張隴清

（運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系1，運(yùn)城 044000）

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2，太原 030006）

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，無(wú)錫 214122）

（山西省農(nóng)科院棉花研究所4，運(yùn)城 044000）

酚酸（phenolic acid）屬于酚類(lèi)化合物，多為苯甲酸和肉桂酸的羥化衍生物，主要有阿魏酸、芥子酸、香豆酸和咖啡酸等［1］。酚酸在植物中主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)存在。近年來(lái)，酚酸作為抵抗癌癥和心臟病的潛在保護(hù)因子，受到越來(lái)越多的關(guān)注，其部分原因在于它們潛在的抗氧化活性、抗癌以及對(duì)慢性疾病的保健功效［2］。

全谷物攝入對(duì)慢性疾病的預(yù)防作用主要?dú)w功于膳食纖維及其與之共價(jià)連接的酚酸類(lèi)物質(zhì)，被稱(chēng)為“膳食纖維-酚類(lèi)抗氧化劑復(fù)合物”，這個(gè)觀點(diǎn)已被廣泛接受［3］。阿魏酸（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸）是谷物中含量最豐富的酚酸類(lèi)物質(zhì)，主要以結(jié)合態(tài)存在［4］。研究表明，阿魏酸具有很強(qiáng)的抗氧化活性，并能調(diào)節(jié)人體免疫功能，通過(guò)抑制脂質(zhì)氧化、降低血清中膽固醇含量和抗血栓作用預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和冠心?。?-8］。

黑小麥?zhǔn)且环N珍貴的黑籽粒小麥品種，屬于優(yōu)質(zhì)特色谷物資源。與普通小麥相比，黑小麥含有更為豐富的膳食纖維、酚酸、花色苷、B族維生素和微量元素等生物活性物質(zhì)，以其特殊的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而備受關(guān)注［9-10］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)已經(jīng)培育出多個(gè)優(yōu)良品種，如河?xùn)|烏麥526、黑小麥76、亞洲1號(hào)、秦黑1號(hào)和紫晶1號(hào)等。但是，針對(duì)黑小麥生物活性物質(zhì)的鑒定和功能性評(píng)價(jià)的研究力度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。國(guó)內(nèi)外科研人員對(duì)小麥、黑麥、大麥、玉米、稻谷等谷物中阿魏酸的含量和功能性展開(kāi)了較為系統(tǒng)的研究［11-13］，對(duì)于黑小麥酚酸物質(zhì)的組成和生物活性研究，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。以黑小麥為原料開(kāi)發(fā)阿魏酸及其與之相結(jié)合的膳食纖維作為天然保健食品功能因子，對(duì)改善人類(lèi)膳食結(jié)構(gòu)、預(yù)防慢性代謝性疾病有著極其重要的意義。

Rondini等［14］報(bào)道，膳食中的結(jié)合態(tài)阿魏酸在腸道以相對(duì)較低的濃度被緩慢而持續(xù)的吸收，其效果比攝入游離態(tài)阿魏酸具有更好的生物利用率。本試驗(yàn)以黑小麥麩皮為原料，對(duì)提取的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚酸進(jìn)行定性分析，并對(duì)結(jié)合態(tài)阿魏酸含量進(jìn)行測(cè)定，為黑小麥特色谷物資源的有效增值和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑小麥（紫?！昂?xùn)|烏麥528”、藍(lán)?！昂?xùn)|烏麥526”）和普通小麥（運(yùn)旱22-33）麩皮：山西省農(nóng)科院棉花研究所提供；阿魏酸：Sigma公司。乙醇、乙醚、甲醇和氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

WATERSMALDISYNAPTQ-TOFMS四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜：美國(guó)Waters公司；Agilent 1100高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；756MC型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海精科分析儀器廠；KQ4200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山超聲儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 游離態(tài)酚酸FPA的提取

將原料粉碎，過(guò)40目篩，稱(chēng)取3 g原料放入150 mL具塞三角瓶中，加入75 mL 80%乙醇超聲避光提取15 min，然后在40℃水浴振蕩器振蕩提取3 h，離心（3 000 r／min，20min），上清液用 HCl溶液調(diào) pH＝2，真空濃縮，乙醚萃取，N2揮干萃取液中的乙醚后，用1 mL甲醇復(fù)溶，得到游離態(tài)酚酸樣品FPA［15］。

1.3.2 結(jié)合態(tài)酚酸CPA的提取

提取液離心后的殘?jiān)尤?0 mL 2 mol／L NaOH溶液，充N(xiāo)2在40℃水浴振蕩條件下避光提取12 h，離心（3 000 r／min，20 min），上清液用 HCl溶液調(diào)pH＝2，真空濃縮，乙醚萃取，N2揮干萃取液中的乙醚后，用1 mL甲醇復(fù)溶，得到結(jié)合態(tài)酚酸樣品CPA［16］。

1.3.3 酚酸樣品的定性分析

紫外（UV）光譜分析：取適量標(biāo)準(zhǔn)阿魏酸以及制備好的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚酸樣品分別用甲醇溶解，配制成1 mg／mL溶液進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，掃描波長(zhǎng)為200～400 nm。

LC／MS分析：色譜條件 Lichrospher C18柱（5 μm，2.1 mm ×250 mm）；流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)10%的乙腈-0.1%的甲酸；梯度洗脫：0～20 min 100% →80%，20～30 min 80%→40%；柱溫30℃；流速0.3 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm；進(jìn)樣量5μL。

質(zhì)譜條件：離子源：EIS源；源電壓3.88 kV；錐孔電壓25 V；離子源溫度120℃；脫溶劑氣溫度300℃；質(zhì)量范圍：200～1 000 m／z；光電倍增器電壓700 V；載氣流速4.2 L／h。液質(zhì)聯(lián)用結(jié)果用 Masslynx V3.1（2）軟件分析。

1.3.4 阿魏酸含量測(cè)定

采用HPLC方法。色譜條件：Symmetry C18柱（5μm，3.9 mm ×150 mm）；流動(dòng)相為乙腈∶水 ＝15∶85；流速 0.8 mL／min；等梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量5μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作：精密稱(chēng)取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇定容至50 mL容量瓶中，配成0.2 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取1、5、10、12、15μL標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣液相色譜儀。以進(jìn)樣量對(duì)色譜峰面積作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為方程 Y＝70.118X-34.095，R2＝0.999。將樣品與標(biāo)準(zhǔn)阿魏酸的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)照，并測(cè)定阿魏酸含量。每個(gè)樣品測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚酸樣品的紫外光譜（UV）分析

將阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品、游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚酸樣品進(jìn)行紫外掃描，紫外吸收光譜如圖1所示。紫外光譜顯示，樣品在286 nm和325 nm處較強(qiáng)的吸收峰為酚酸分子中苯環(huán)的特征吸收。210～250 nm出現(xiàn)的強(qiáng)吸收帶，也表明分子骨架具有環(huán)狀共軛雙鍵體系。經(jīng)比較，2個(gè)樣品與阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸收特征峰相似，表明游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚酸具有與阿魏酸相似的分子結(jié)構(gòu)。

圖1 游離態(tài)酚酸FPA（A）和結(jié)合態(tài)酚酸CPA（B）的紫外吸收光譜

2.2 游離態(tài)酚酸FPA的定性分析

LC／MS是以HPLC為分離手段，以MS為鑒定方法的分離分析方法。液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了樣品的分離和鑒定，是對(duì)未知物質(zhì)定性分析的強(qiáng)有力工具。圖2為游離態(tài)酚酸樣品的LC／MS總離子流圖及其主峰所對(duì)應(yīng)的一級(jí)質(zhì)譜圖。圖2a顯示，游離態(tài)酚酸樣品FPA被分離為2個(gè)主要組分A和B，保留時(shí)間分別為3.83 min和4.17 min。組分A和B的ESI-MS圖譜均顯示相同的負(fù)離子峰m／z：223.1［M-1］-，可以判斷，2種游離態(tài)酚酸物質(zhì)為一對(duì)同分異構(gòu)體，且相對(duì)分子質(zhì)量為224。

圖2 游離態(tài)酚酸FPA的LC／MS總離子流圖和峰A、峰B的MS圖

圖3是在一級(jí)質(zhì)譜圖的基礎(chǔ)上對(duì)粒子進(jìn)行轟擊得到的LC／MS／MS總離子流圖及其主峰所對(duì)應(yīng)的二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖。在ESI-MS／MS條件下，母離子m／z 223.1（［M-1］-）經(jīng)裂解后，發(fā)生鍵的斷裂，生成的碎片離子主要有 m／z 193.1（［M-1］-）、178、149、134，歸屬為阿魏酸，相對(duì)分子質(zhì)量為194。碎片離子m／z193.1相對(duì)于母離子m／z223.1丟失了2個(gè)CH3（m／z 15）。由此，可以確定游離態(tài)酚酸FPA為芥子酸，相對(duì)分子質(zhì)量為224。

圖3 游離態(tài)酚酸FPA的LC／MS／MS總離子流圖和峰 A、峰 B的 MS／MS圖

2.3 結(jié)合態(tài)酚酸CPA的定性分析

圖4為結(jié)合態(tài)酚酸樣品的LC／MS總離子流圖及其所對(duì)應(yīng)的一級(jí)質(zhì)譜圖。圖4c顯示，結(jié)合態(tài)酚酸樣品CPA被分離為2個(gè)主要組分A和組分B，保留時(shí)間分別為3.76min和4.13min。組分A和組分B的ESI-MS圖譜均顯示相同的負(fù)離子峰，m／z 193.1［M-1］-。準(zhǔn)分子離子 m／z 193.1［M-1］-經(jīng)裂解后，發(fā)生鍵的斷裂，丟失了 CH3（m／z 15）、COOH（m／z 44）等基團(tuán)，生成的碎片離子主要有 m／z 178、149、134，歸屬為阿魏酸，從而可以判斷2種酚酸組分為一對(duì)同分異構(gòu)體。由此，可以確定結(jié)合態(tài)酚酸CPA主要為阿魏酸，相對(duì)分子質(zhì)量為194。

圖4 結(jié)合態(tài)酚酸CPA的LC／MS總離子流圖和峰A、峰B的MS圖

2.4 阿魏酸含量測(cè)定

采用HPLC對(duì)紫粒和藍(lán)粒黑小麥麩皮中的結(jié)合態(tài)阿魏酸含量進(jìn)行測(cè)定。阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的HPLC圖譜見(jiàn)圖5。阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的出峰保留時(shí)間為10.509 min，樣品的最大吸收峰保留時(shí)間與阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰保留時(shí)間吻合。對(duì)應(yīng)出峰時(shí)間，根據(jù)峰面積計(jì)算結(jié)合態(tài)阿魏酸含量，結(jié)果如表1所示。

圖5 黑小麥麩皮結(jié)合態(tài)阿魏酸的HPLC圖譜

由表1可知，紫粒黑小麥麩皮的結(jié)合態(tài)阿魏酸含量為2.07 mg／g，與藍(lán)粒黑小麥麩皮含量（2.12 mg／g）相近，其含量高于當(dāng)?shù)胤N植的普通小麥麩皮的阿魏酸含量（1.17 mg／g）。

表1 黑小麥麩皮結(jié)合態(tài)阿魏酸含量

3 結(jié)論

對(duì)紫粒、藍(lán)粒黑小麥麩皮中的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚酸進(jìn)行制備。通過(guò)紫外光譜判斷2種酚酸物質(zhì)具有與阿魏酸相似的分子結(jié)構(gòu)。采用LC／MS對(duì)酚酸樣品進(jìn)行定性檢測(cè)，結(jié)果顯示，游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚酸的相對(duì)分子質(zhì)量分別為224和194，由此判斷，黑小麥麩皮中的游離態(tài)酚酸FPA主要為芥子酸，結(jié)合態(tài)酚酸CPA主要為阿魏酸。

采用HPLC對(duì)紫粒、藍(lán)粒黑小麥麩皮中的結(jié)合態(tài)阿魏酸含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，紫粒黑小麥麩皮的阿魏酸含量為2.07 mg／g，與藍(lán)粒黑小麥麩皮的阿魏酸含量（2.12 mg／g）相近，其含量高于當(dāng)?shù)胤N植的普通小麥麩皮的阿魏酸含量（1.17 mg／g）。

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