李馥邑 王文俠 徐偉麗 張慧君 張顯斌

（齊齊哈爾大學食品與生物工程學院黑龍江省普通高校農產品加工重點實驗室1，齊齊哈爾 161006）

（哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院2，哈爾濱 150090）

多糖是一類具有豐富結構多樣性的特殊生物大分子，可通過生物途徑普遍在有機體內合成，并參與細胞的各種生命活動，具有抗衰老、抗氧化、抗癌、抗誘變等生物活性。硫酸多糖是一類在糖鏈上帶有硫酸基團的多糖，通過對天然硫酸多糖研究已證實其具有突出的抗病毒活性，而這與硫酸根的存在息息相關［1］。近年來，多糖硫酸化結構修飾在賦予或增強天然多糖的活性，降低某些藥物的毒副作用等方面已取得一定的進展，包括抗病毒、抗凝血、抗腫瘤、調節(jié)免疫系統(tǒng)等功效［2］。

玉米作為我國主要的農作物之一，2012年其年產量高達2.08億t，位居世界第二。玉米皮是玉米深加工的副產物，占玉米籽粒的15%，其主要成分為半纖維素、纖維素及木質素等，是良好的食用、藥用植物活性多糖來源。但由于缺乏相應的基礎理論研究，絕大多數用于飼料生產或廢棄，并未得到充分利用，造成食物資源浪費。國內外已有研究表明玉米皮活性多糖有良好的物性及生物活性［3-5］，但目前未見有關玉米皮活性多糖結構修飾方面的研究報道。

本試驗以堿性過氧化氫法提取的玉米皮多糖（APCP）為原料，對氯磺酸-吡啶法制備硫酸酯化玉米皮多糖（SAPCP）的工藝條件進行了優(yōu)化，并研究了硫酸酯化玉米皮多糖清除羥基自由基的能力，以期了解多糖硫酸化修飾對玉米皮多糖抗氧化活性的影響，為玉米皮多糖及其衍生物的開發(fā)利用提供相關的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米皮多糖（APCP），以脫脂玉米皮為原料，經除淀粉、蛋白質及水溶性多糖后采用堿性過氧化氫法提取，醇沉后冷凍干燥制得［6］。

1.2 儀器與設備

UV757CRT紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；TDL-5-A型低速臺式離心機：北京醫(yī)用離心機廠；102041真空冷凍干燥機：CHRIST；HH-S1電熱恒溫水浴鍋：上海躍進醫(yī)療儀器廠；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 硫酸酯化玉米皮多糖的制備

將帶有冷凝管和攪拌裝置的三頸瓶置于冰鹽浴中冷卻，加入預冷的無水吡啶，在劇烈攪拌狀態(tài)下按照一定比例緩慢滴加氯磺酸，反應溫度控制在室溫以下，反應在30 min內完成，結束后得到淡黃色的酯化試劑。精確稱取一定量玉米皮多糖，將其溶解于一定體積的 N，N-二甲基甲酰胺中，加入到配置好的酯化試劑中，在一定溫度下攪拌反應一定時間，反應結束后，于冰浴中冷卻，用 4 mol／L NaOH調pH至7，加入4倍體積無水乙醇后靜置過夜，收集醇析后沉淀并將其用蒸餾水復溶，流水透析72 h，蒸餾水透析12 h，透析液真空濃縮后冷凍干燥，得SAPCP。

1.3.2 酯化試劑比例對SAPCP取代度的影響

按照1.3.1的方法，調節(jié) V氯磺酸：V吡啶的比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，在酯化試劑與多糖溶液的體積比4∶3，反應溫度70℃，反應時間2 h的條件下完成反應，測定不同酯化試劑比例下SAPCP的取代度。

1.3.3 酯化試劑與多糖溶液的體積比對SAPCP取代度的影響

按照 1.3.1的方法，調節(jié) V酯化試劑：V多糖溶液的比例為 4∶1、4∶2、4∶3、4∶4、4∶5，在酯化試劑比 1∶3，反應溫度70℃，反應時間2 h的條件下完成反應，測定不同酯化試劑與多糖溶液體積比例下SAPCP的取代度。

1.3.4 不同反應溫度對SAPCP取代度的影響

按照1.3.1的方法，調節(jié)反應溫度分別為40、50、60、70、80℃，在酯化試劑比1∶3，酯化試劑與多糖溶液的體積比4∶3，反應時間2 h的條件下完成反應，測定不同反應溫度下SAPCP的取代度。

1.3.5 不同反應時間對SAPCP取代度的影響

按照1.3.1的方法，調節(jié)反應時間分別為1、2、3、4 h，將 V氯磺酸：V吡啶的比例，在酯化試劑比 1∶3，酯化試劑與多糖溶液的體積比4∶3，反應溫度70℃的條件下完成反應，測定不同反應時間下SAPCP的取代度。

1.4 玉米皮多糖硫酸酯化工藝條件優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗法確定APCP硫酸酯化的最佳工藝條件。按照酯化試劑比例、酯化試劑與多糖溶液的體積比、反應溫度及反應時間做四因素三水平正交試驗。

1.5 硫酸基含量的測定及取代度計算

硫酸基含量的測定采用氯化鋇-明膠濁度法［7］。

樣品預處理：精確稱取SAPCP 250 mg，溶于250 mL鹽酸（1 mol／L）中，沸水浴4 h使其完全水解。采用氯化鋇-明膠濁度法對硫酸基含量進行測定，進而計算樣品中的硫的百分含量。

取代度計算公式［8］為：

DS＝（1.62×S）／（32-1.02×S）

式中：S為硫酸酯化多糖中硫的質量分數／%。

1.6 SAPCP抗氧化活性的測定

采用鄰二氮菲-Fe2＋氧化法［9］測定離體試驗體系中羥自由基的氧化作用。分別按表1加入試劑及多糖樣品，搖勻后放入37℃水浴中保溫1 h，測定其在536 nm處的吸光度值，清除率計算公式：

表1 鄰二氮菲-H2 O2／Fe2＋體系加樣表／mL

1.7 數據分析

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同酯化試劑比例對SAPCP取代度的影響酯化試劑（氯磺酸∶吡啶）比例對SAPCP的取代度的影響如圖1所示。

圖1 酯化試劑比例對SAPCP取代度的影響

如圖1所示，SAPCP的取代度隨著氯磺酸∶吡啶的比例增大而增大；但比例超過1∶3時，多糖的取代度卻有所下降。由于氯磺酸是一種含硫酸基的強酸，當氯磺酸含量過高時，會導致多糖部分降解，影響硫酸化效果；而其含量過低時，酯化不完全，取代度降低。因此氯磺酸與吡啶的比例太大或太小都會影響硫酸化效果，故選擇氯磺酸與吡啶的比例為1∶3。經單因素方差分析，酯化試劑比例對SAPCP取代度影響顯著（P＜0.01）。

2.1.2 酯化試劑與多糖溶液的體積比對SAPCP取代度的影響

酯化試劑與多糖溶液的體積比對SAPCP取代度的影響，如圖2所示。

圖2 酯化試劑與多糖溶液的體積比對SAPCP取代度的影響

如圖2所示，隨著酯化試劑與多糖溶液的體積比增大，SAPCP的取代度也隨著增大；但超過一定的比例時，取代度卻在緩慢的降低。圖2中酯化試劑與多糖溶液的體積比為4∶4時取代度最大，當酯化試劑與多糖溶液的體積比過低時，會出現(xiàn)碳化現(xiàn)象；過高時，多糖不能完全被酯化，影響酯化效果。因此選擇酯化試劑與多糖溶液的體積比為4∶4。經單因素方差分析，酯化試劑與多糖溶液的體積比對SAPCP取代度影響顯著（P＜0.01）。

2.1.3 反應溫度對SAPCP取代度的影響

反應溫度對與SAPCP取代度的影響如圖3所示。

圖3 反應溫度對SAPCP取代度的影響

如圖3所示，隨著反應溫度的增加SAPCP的取代度先增后減。當溫度高于70℃時，取代度降低可能是因為玉米皮多糖在酯化過程中出現(xiàn)碳化現(xiàn)象，影響酯化效果，因此選擇反應溫度為70℃。經單因素方差分析，反應溫度對SAPCP取代度影響顯著（P＜0.01）。

2.1.4 反應時間對SAPCP取代度的影響

圖4 反應時間對SAPCP取代度的影響

不同反應時間對SAPCP取代度的影響見圖4。如圖4所示，隨著反應時間的增加，SAPCP的取代度呈上升趨勢，但隨著反應時間的延長，多糖的酯化程度降低。可能因為在高酸性的條件下，酯化時間過長，造成多糖的部分降解所致，因此選擇時間為3 h。經單因素方差分析，反應時間對SAPCP取代度影響顯著（P＜0.01）。

2.2 玉米皮多糖硫酸酯化的最佳工藝條件的確定

在單因素的基礎上，采用酯化試劑比例、酯化試劑與多糖溶液的體積比、反應溫度和反應時間四因素進行L9（34）正交試驗，以確定玉米皮多糖硫酸酯化的最佳工藝條件。選用因素及水平見表2，正交試驗結果見表3，方差分析見表4。

表2 因素水平表

表3 正交試驗結果

表4 方差分析

由正交試驗結果可以看出，各因素作用主次順序排序如下：B＞A＞D＞C，與極差分析結果一致，即酯化試劑與多糖溶液的體積比影響最大，其次依次是酯化試劑比例、反應溫度和反應時間。由k值可知最佳組合為A2B2C2D2。方差分析結果表明各因素對該酯化反應均極顯著。經重復試驗驗證該最佳條件下多糖的取代度最高，達2.85。因此確定最佳的硫酸酯化工藝為：酯化試劑比例為1∶3，酯化試劑與多糖溶液體積比為4∶4，反應溫度為70℃，反應時間為3h。

2.3 SAPCP的抗氧化活性

分別配置濃度為 2、4、6、8、10mg／mL的 SAPCP和APCP溶液，這2種多糖對羥自由基的清除作用如圖5所示。

圖5 不同濃度的多糖溶液對羥自由基的清除率

從圖5中可以看出2種多糖溶液對羥自由基都有清除作用，而且隨著溶液濃度的增大，清除作用也在增強。在給定濃度范圍內，多糖經硫酸化后對羥自由基清除能力大幅提升，在多糖濃度為10mg／mL時清除率約為原多糖的6倍，高達72%。而SAPCP在低濃度下也表現(xiàn)出較高清除能力，并明顯高于高濃度下APCP。方差分析結果表明，多糖濃度對羥自由基清除作用效果顯著（P＜0.01）。

由此可見APCP經硫酸酯化后，抗氧化活性明顯提高，可能是由于多糖單位的羥基被硫酸基取代后，糖環(huán)構象可能扭曲或轉變并利于形成非共價鍵，這些陰離子基團間的排斥作用使糖鏈鏈段伸長［10］，而且部分硫酸基可能會和糖環(huán)上的羥基形成氫鍵，因而在糖鏈局部可能形成螺旋結構，糖鏈較為伸展，有序性明顯增加，從而使其黏度降低，與自由基的結合能力增強［11］。

3 結論

3.1 玉米皮多糖硫酸酯化的最佳工藝條件為：氯磺酸與吡啶的體積比為1∶3，酯化試劑與多糖溶液的體積比為4∶4，反應溫度為70℃，反應時間為3h。在此條件下，硫酸化玉米皮多糖取代度達到2.85。

3.2 硫酸化玉米皮多糖對羥基自由基有較高的清除作用，并呈明顯的量效關系。

3.3 氯磺酸-吡啶法制備硫酸化玉米皮多糖的工藝可行。

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