趙書(shū)林 何東平 陳 濤 田 華，3 佘 雋，3 王文翔

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院1，武漢 430023）

（中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所2，武漢 430060）

（武漢博特爾油脂科技有限公司3，武漢 430040）

寇氏隱甲藻（Crypthecodinium cohnii）是一種海生、無(wú)色、異養(yǎng)雙鞭毛甲藻，多生長(zhǎng)在腐敗的大型褐藻上，也可在瓊脂板上生長(zhǎng)，屬于從原核生物向真核生物的過(guò)度類(lèi)型。目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道寇氏隱甲藻藻體中，產(chǎn)油率高達(dá)10%～15%，DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)35%～40%。2010國(guó)家衛(wèi)生部正式批準(zhǔn)由寇氏隱甲藻等藻種經(jīng)生物發(fā)酵、提取、精煉等工藝制取的DHA藻油為新資源食品［1］。利用寇氏隱甲藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)富含DHA的油脂，具有很大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效應(yīng)［2］。寇氏隱甲藻在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期之前主要利用碳源和氮源進(jìn)行自身的生長(zhǎng)繁殖和油脂積累；生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期之后若沒(méi)有及時(shí)的碳源補(bǔ)給，寇氏隱甲藻便會(huì)分解自身的油脂來(lái)提供生存所必需的能量，此時(shí)應(yīng)該及時(shí)補(bǔ)糖，保證寇氏隱甲藻有充足的碳源來(lái)進(jìn)行油脂的積累。De Swaaf等［3］報(bào)道當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度高于25 g／L時(shí)，對(duì)寇氏隱甲藻的生長(zhǎng)速率有抑制作用；在葡糖糖質(zhì)量濃度高達(dá)84.3 g／L時(shí)寇氏隱甲藻也能生長(zhǎng)；當(dāng)?shù)促|(zhì)量濃度為2 g／L時(shí)，寇氏隱甲藻產(chǎn)可以合成更多的 DHA；Wang等［4］、Mendes等［5］研究也指出當(dāng)碳／氮比在15∶1左右時(shí)補(bǔ)糖最佳。因此研究發(fā)酵液中的糖、氮代謝過(guò)程，可以提高產(chǎn)油率和DHA含量。

1 材料與方法

1.1 藻種

寇氏隱甲藻（Crypthecodinium cohnii突變株2.4K-2A2-5），本實(shí)驗(yàn)室保存［6］。

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：葡萄糖、谷氨酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、氯化鈉、硫酸鎂、金屬離子混合液、維生素混合液、瓊脂。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖、谷氨酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鉀、金屬離子混合液、維生素混合液。

1.3 試劑

正己烷、鹽酸、硫酸、硼酸、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、乙酸鋅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、甲醇、95%乙醇、亞甲基藍(lán)、甲基紅、纖維素酶（酶活：10～140 U／g），、堿性蛋白酶（酶活：20萬(wàn) U／g），試驗(yàn)所用的試劑均為分析純。

1.4 儀器與設(shè)備

Agilent7890A氣相色譜儀：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；SPX-150C恒溫恒濕箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-75KB立式蒸汽滅菌器：武漢利天科技儀器有限公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠。

1.5 發(fā)酵條件的討論

對(duì)照組和5個(gè)補(bǔ)糖的試驗(yàn)組初始葡萄糖質(zhì)量濃度均為70 g／L，分別記為 A、B、C、D、E、F。A為對(duì)照組，B組在24 h時(shí)補(bǔ)糖10 g，C組在48 h時(shí)補(bǔ)糖10 g，D組在72 h時(shí)補(bǔ)糖10 g，E組在96 h時(shí)補(bǔ)糖10 g，F(xiàn)組在120 h時(shí)補(bǔ)糖10 g。每組試驗(yàn)隔24 h觀察碳和氮的利用情況，最后收獲藻體提取油脂，測(cè)定每組的生物量、產(chǎn)油率、DHA%和DHA產(chǎn)量。

1.6 分析方法

1.6.1 還原糖質(zhì)量濃度的測(cè)定［7］

1.6.1.1 樣品預(yù)處理吸取20 mL樣品和20 mL水，置于150 mL錐形瓶中充分混勻，然后取10 mL混合液，繼續(xù)添加3 mL濃度6 mol／L的鹽酸，加入玻璃珠2粒，加熱至沸15～20 min，待充分水解后冷卻至室溫調(diào)pH至7，定容至100 mL的容量瓶，然后過(guò)濾到150 mL錐形瓶中，取續(xù)濾液備用。

1.6.1.2 標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液

吸取5 mL堿性酒石酸銅甲液與5 mL堿性酒石酸銅乙液，置于150 mL錐形瓶中，加10 mL水，加入玻璃珠2粒，從滴定管滴加約9 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，控制在2 min內(nèi)加熱至沸，趁熱以1滴／2 s的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積，同時(shí)平行操作3份，取平均值，計(jì)算每10 mL堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量。

1.6.1.3 試樣溶液預(yù)測(cè)

吸取5 mL堿性酒石酸銅甲液與5 mL堿性酒石酸銅乙液，置于150 mL錐形瓶中，加10 mL水，加入玻璃珠兩粒，控制在2 min內(nèi)加熱至沸，保持沸騰以先快后慢的速度，從滴定管中滴加試樣溶液，并保持沸騰的狀態(tài)，待溶液變淺時(shí)，以1滴／2 s的速度滴定，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣液消耗體積（如果樣品殘?zhí)菨舛绕停上燃尤胍欢康臉?biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，再滴加試樣溶液滴定至終點(diǎn)）。

1.6.1.4 試樣溶液測(cè)定

吸取5 mL堿性酒石酸銅甲液與5 mL堿性酒石酸銅乙液，置于150 mL錐形瓶中，加10 mL水，加入玻璃珠2粒，從滴定管滴加比預(yù)測(cè)體積少1 mL的試樣溶液至錐形瓶中，使在2 min內(nèi)加熱至沸，保持沸騰繼續(xù)以1滴／2s的速度滴定，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣液消耗體積。同法平行操作3份，得出平均消耗體積（如果樣品殘?zhí)菨舛绕?，可先加入一定量的?biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，再滴加試樣溶液滴定至終點(diǎn)）。

1.6.1.5 計(jì)算還原糖含量

試樣中還原糖的質(zhì)量濃度計(jì)算：

式中：X為試樣中還原糖的含量／g／L，V1為堿性酒石酸銅溶液消耗的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖的體積／mL；V2為消耗葡萄糖的體積／mL；V為消耗試樣的體積／mL，20為化簡(jiǎn)后的系數(shù)／g／L。

1.6.2 氨基酸質(zhì)量濃度的測(cè)定［8］

取用4層紗布過(guò)濾后的試樣2 mL，加10 mL水，加1滴甲基紅，以0.3 mol／L的硫酸溶液調(diào)制紅色，再以0.1 mol／l的氫氧化鈉溶液調(diào)制橙黃色，再加4 mL的18%中性甲醛，靜置10 min，滴加8滴酚酞試劑，然后用0.1 mol／L的氫氧化鈉溶液滴定，直至溶液顏色剛好為微紅為終點(diǎn)，記錄樣液消耗體積。同法平行操作3份，得出平均消耗體積。

試樣中氨基酸的質(zhì)量濃度計(jì)算：

式中：X為試樣中氨基酸的含量／g／L，V是平均消耗的氫氧化鈉體積／mL。

1.7 色譜條件

色譜柱：Agilent SP-2560（100 m×25μm，0.2 μm）；升溫程序：100℃保持4 min，以3℃／min升溫至230℃，保持20min，載氣（N2）流速25 mL／min，壓力 2.4 kPa，進(jìn)樣量1μL；分流比 15∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 寇氏隱甲藻突變株對(duì)碳、氮利用的變化

寇氏隱甲藻突變株對(duì)碳、氮利用的變化如表1。本試驗(yàn)分別在 0、24、48、72、96、120、144、168 h等時(shí)刻測(cè)定寇氏隱甲藻突變株對(duì)發(fā)酵液中碳、氮的利用情況；A為對(duì)照組，B、C、D、E、F為5個(gè)不同的補(bǔ)糖試驗(yàn)組。

首先測(cè)定了每組試驗(yàn)初始葡萄糖和氨基酸質(zhì)量濃度均為67.74 g／L和1.89 g／L，說(shuō)明用斐林試劑法和甲醛法可以準(zhǔn)確測(cè)定寇氏隱甲藻突變株對(duì)發(fā)酵液中碳、氮的利用情況。

其次，當(dāng)發(fā)酵至24 h時(shí)B組開(kāi)始補(bǔ)糖10 g，此時(shí)測(cè)定B組與其他試驗(yàn)組相比葡萄糖質(zhì)量濃度略有上升，而氨基酸質(zhì)量濃度基本一致；當(dāng)發(fā)酵至48 h時(shí)C組開(kāi)始補(bǔ)糖10 g，此時(shí)測(cè)定C組葡萄糖質(zhì)量濃度高于A、D、E、F組，但低于B組，每組氨基酸質(zhì)量濃度基本一致；當(dāng)發(fā)酵至72 h時(shí)D組開(kāi)始補(bǔ)糖10 g，此時(shí)測(cè)定D組葡萄糖質(zhì)量濃度最高，且在48～72 h之間寇氏隱甲藻突變株對(duì)糖的利用率最大，每組氨基酸濃度基本一致；當(dāng)發(fā)酵至96 h時(shí)E組開(kāi)始補(bǔ)糖10 g，此時(shí)測(cè)定E組葡萄糖質(zhì)量濃度最高，A、B、C、D、F組葡萄糖和氨基酸質(zhì)量濃度基本一致；當(dāng)發(fā)酵至120 h時(shí)F組開(kāi)始補(bǔ)糖10 g，此時(shí)測(cè)定F組葡萄糖質(zhì)量濃度最高，A、B、C、D、E組葡萄糖和氨基酸質(zhì)量濃度基本一致；當(dāng)發(fā)酵144 h以后測(cè)定 A、B、C、D、E、F組葡萄糖和氨基酸質(zhì)量濃度基本不變。

表1 寇氏隱甲藻突變株對(duì)碳、氮利用的變化

最后，嘗試在144 h收獲藻體，因?yàn)?44 h后發(fā)酵液中的碳、氮消耗基本趨于穩(wěn)定，不再被寇氏隱甲藻突變株利用。

2.2 不同時(shí)期的補(bǔ)糖對(duì)寇氏隱甲藻突變株糖、氮代謝的影響

將對(duì)照組和試驗(yàn)組發(fā)酵培養(yǎng)7 d，每隔24 h觀察碳、氮的利用情況，繪制趨勢(shì)圖，如圖1～圖6。

從圖1首先看出對(duì)照組A前72 h糖耗為93.0%左右，氮耗為80.0%左右；說(shuō)明前72 h是寇氏隱甲藻利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要時(shí)期，72 h后碳源和氮源消耗趨于穩(wěn)定；其次前72 h糖耗的速率先慢后快，而氮耗的速率則是先快后慢［9-10］。當(dāng)168 h收獲時(shí)發(fā)酵液中剩余殘?zhí)琴|(zhì)量濃度僅5.34 g／L，氨基酸質(zhì)量濃度為 0.35 g／L，碳氮比約為 15∶1。

圖1 對(duì)照組A碳、氮利用變化曲線

圖2 試驗(yàn)組B碳、氮利用變化曲線

從圖2看出試驗(yàn)組B與對(duì)照組相比氨基酸質(zhì)量濃度曲線基本不變，還原糖質(zhì)量濃度曲線在24 h時(shí)略有上升；96 h后趨于穩(wěn)定，此時(shí)糖耗為92.3%左右，氮耗為81.5%左右；當(dāng)168 h放瓶收獲時(shí)發(fā)酵液中剩余殘?zhí)琴|(zhì)量濃度僅5.37 g／L，氨基酸質(zhì)量濃度為 0.32 g／L，碳／氮比約為 18∶1。

圖3 試驗(yàn)組C碳、氮利用變化曲線

從圖3看出試驗(yàn)組C與對(duì)照組相比氨基酸質(zhì)量濃度曲線基本不變，還原糖質(zhì)量濃度曲線在48 h時(shí)略有上升；96 h后趨于穩(wěn)定，此時(shí)糖耗為92.3%左右，氮耗為77.8%左右；當(dāng)168 h放瓶收獲時(shí)發(fā)酵液中剩余殘?zhí)琴|(zhì)量濃度僅5.50 g／L，氨基酸質(zhì)量濃度為 0.32 g／L，碳氮比約為 17∶1。

圖4 試驗(yàn)組D碳、氮利用變化曲線

從圖4看出試驗(yàn)組D與對(duì)照組相比氨基酸質(zhì)量濃度曲線基本不變，還原糖質(zhì)量濃度曲線在72 h時(shí)略有上升；96 h后趨于穩(wěn)定，此時(shí)糖耗為92.6%左右，氮耗為81.49%左右；當(dāng)168 h放瓶收獲時(shí)發(fā)酵液中剩余殘?zhí)琴|(zhì)量濃度僅5.37 g／L，氨基酸質(zhì)量濃度為 0.35 g／L，碳／氮比約為 15∶1。

圖5 試驗(yàn)組E碳、氮利用變化曲線

從圖5看出，試驗(yàn)組E與對(duì)照組相比氨基酸質(zhì)量濃度曲線基本不變，還原糖質(zhì)量濃度曲線在96 h時(shí)略有上升；前72 h糖耗為92.7%左右，氮耗為79.4%左右；當(dāng)96 h補(bǔ)10 g時(shí)時(shí)，發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葹?6.2%左右，氨基酸濃度為20.0%左右；當(dāng)168 h放瓶收獲時(shí)發(fā)酵液中剩余殘?zhí)琴|(zhì)量濃度僅5.24 g／L，氨基酸質(zhì)量濃度為 0.32 g／L，碳／氮比約為 16∶1。

圖6 試驗(yàn)組F碳、氮利用變化曲線

從圖6看出試驗(yàn)組F與對(duì)照組相比氨基酸質(zhì)量濃度曲線基本不變，還原糖質(zhì)量濃度曲線在120 h時(shí)略有上升；前72 h糖耗為92.7%左右，氮耗為79.4%左右；當(dāng)120 h補(bǔ)糖10 g時(shí)，發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葹?0.6%左右，氨基酸濃度為17.0%左右；當(dāng)168 h放瓶收獲時(shí)發(fā)酵液中剩余殘?zhí)琴|(zhì)量濃度僅5.37 g／L，氨基酸質(zhì)量濃度為0.35 g／L，碳／氮比約為15∶1。

2.3 補(bǔ)糖對(duì)寇氏隱甲藻干重、產(chǎn)油率及DHA的影響

試驗(yàn)組 B、C、D、E、F中干重、產(chǎn)油率、DHA產(chǎn)量及含量明顯高于對(duì)照組，特別是F組的產(chǎn)油率及DHA產(chǎn)量分別比對(duì)照組高出了42.58%和49.30%。

表2 對(duì)照組和試驗(yàn)組的干重、產(chǎn)油率、DHA產(chǎn)量及含量

3 討論與結(jié)論

從補(bǔ)糖來(lái)看，5個(gè)不同的補(bǔ)糖試驗(yàn)組油脂的干重、產(chǎn)油率、DHA產(chǎn)量及含量明顯高于對(duì)照組，當(dāng)寇氏隱甲藻細(xì)胞受到氮源的限制，油脂濃度成指數(shù)增長(zhǎng)。說(shuō)明油脂的積累是在細(xì)胞生長(zhǎng)受限的條件下進(jìn)行的，細(xì)胞不會(huì)消耗自身合成的油脂；在線性生長(zhǎng)時(shí)，營(yíng)養(yǎng)限制使得細(xì)胞生長(zhǎng)受限因此產(chǎn)生更多的油脂，并且充足的營(yíng)養(yǎng)供給可能導(dǎo)致更多的飽和脂肪酸合成，相反氮源的限制可能使得更多的不飽和脂肪酸形成［11］。本試驗(yàn)結(jié)果也表明當(dāng)?shù)春谋M時(shí)補(bǔ)糖不僅可以促進(jìn)油脂的產(chǎn)生，而且對(duì)DHA的形成也是有利的。

前72 h是寇氏隱甲藻生長(zhǎng)的重要時(shí)期，隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，碳氮比會(huì)一直下降。當(dāng)對(duì)照組發(fā)酵至120 h時(shí)，發(fā)酵液中的碳氮比約為15∶1，此時(shí)補(bǔ)糖的F組干重、產(chǎn)油率、DHA產(chǎn)量及含量達(dá)到本試驗(yàn)最高。

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