曾志青,李金鳳,謝 笛,湯石林

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科,湖南衡陽421001;2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院;3.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科)

革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分脂多糖(LPS)可以作用于炎癥和免疫細(xì)胞,如單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等,誘導(dǎo)體內(nèi)急性時相反應(yīng)(acute phase reaction,APR)[1]。研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)給予LPS刺激能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積和泡沫細(xì)胞形成,從而加速動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)等慢性炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。然而,LPS誘導(dǎo)的APR對膽固醇流出的影響尚不明確,而APR與膿毒癥等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 A1(ABCA1)是一種膜整合蛋白,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)流出,與高密度脂蛋白(HDL)的形成和膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport,RCT)密切相關(guān)[5]。ABCA1的表達(dá)和功能受到多種因素的調(diào)控,例如,炎癥因子干擾素γ(IFN-γ)可通過下調(diào)肝X受體α(liver X receptor α,LXRα),抑制 ABCA1 的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出[6]。研究發(fā)現(xiàn),APR能調(diào)節(jié)體內(nèi)RCT,從而參與機(jī)體對免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用[7]。本文擬建立LPS誘導(dǎo)的APR小鼠模型,觀察LPS對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)和膽固醇流出的影響,并探討LXRα信號途徑在此過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠購自南華大學(xué)實(shí)驗動物中心;1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;LPS購自美國Sigma公司;22(R)-Hch購自美國Sigma公司;Reverse Transcription System(ReverAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit,#k1622)購自美國 Promega公司;ABCA1、LXRα兔抗鼠一抗購自Novus公司;β-actin兔抗鼠一抗購自武漢博士德公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自武漢博士德公司;Western blot熒光檢測試劑盒購自武漢博士德公司;ELISA試劑盒購自武漢博士德公司;硝酸素纖維膜(NC)、PVDF購自Minipore公司;小牛血清購自杭州四季青公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 動物及分組

從南華大學(xué)實(shí)驗動物中心購買60只C57小鼠,分成兩組,實(shí)驗組45只,其中的15只經(jīng)靜脈注射LPS(1.0 mg/kg),另外15只采用LXRα特異性激動劑22(R)-Hch(50 mg/kg)腹腔注射預(yù)處理(給藥劑量按有效劑量換算)24 h,剩余的15只采用22(R)-Hch 24 h后再用LPS處理,對照組15只靜脈注射等量的生理鹽水。靜脈注射12 h采血超離心后用ELISA法檢測血清淀粉樣蛋白(SAA)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素6(IL-6)的水平,驗證LPS制備小鼠APR模型成功。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

按說明書方法,將100 μL樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入板孔,蓋上封板膜,室溫孵育2 h?？廴タ變?nèi)液體,重復(fù)洗板3次。加入50 μL生物素標(biāo)記抗體,孵育2 h。扣去孔內(nèi)液體,又重復(fù)洗板3次。加入抗生物素蛋白鏈菌素-HRP,室溫孵育30 min。重復(fù)洗板3次后,加入顯色劑,室溫孵育15 min。終止反應(yīng)后,用450 nm波長讀值。

1.4 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

將1 μg總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)反轉(zhuǎn)錄成20 μL cDNA。實(shí)時定量PCR在應(yīng)用生物系統(tǒng)7900HT(Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System)上進(jìn)行,采用DyNAmoTMSYBR?Green qPCR Kits(FINNZYMES公司)試劑盒。鼠ABCA1、LXRα和β-actin的PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,60℃復(fù)性30 s,72℃延伸45 s,共35個循環(huán),72℃延伸10 min。鼠ABCA1 引物序列:上游 5′-GAT TGG CTT CAG GAT GTC CAT GTT GGA A-3′, 下游 5′-GTA TTT TTG CAA GGC TAC CAG TTA CAT TTG ACA A-3′。 鼠LXRα 引物序列:上游 5′-AGC GTC CAC TCA GAG CAA GT-3′,下游 5′-GG G GAC AGA ACA GTC ATT CG-3′。 鼠 β-actin 的引物序列:上游 5′-TCA CCA TCT TCC AGG AGC GAG-3′,下游 5′-TGT CGC TGT TGA AGT CAG AG-3′。擴(kuò)增混合體系包括:去離子水 13.5 μL,Master Mix 15 μL,cDNA 1 μL,Primer 0.5 μL,共30 μL。溶解曲線分析表明 PCR反應(yīng)產(chǎn)物為單獨(dú)的雙鏈DNA。用ΔΔCt值法,以β-actin表達(dá)為內(nèi)參定量其它基因的表達(dá)。

1.5 Western印跡分析

收集各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,經(jīng) PBS離心(4℃,3 000 rmp,10 min)洗滌3次,于懸浮緩沖液中裂解后,離心(4℃,10 000 rmp,10 min)收集上清液,用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取提取的蛋白質(zhì)樣品:5×SDS上樣緩沖液:10%β-巰基乙醇以16∶4∶1混勻。100℃煮6～8 min,6%或10%SDS-PAGE電泳(積層膠80 V,分離膠120V)后電轉(zhuǎn)移(100 mA,1.5 h)至PVDF膜上,麗春紅染色觀察蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移情況。5%脫脂牛奶室溫封閉4 h,分別加入1∶500 LXRα、ABCA1和β-actin一抗4℃孵育4～8 h,TBST洗滌3次,每次10 min。加入1∶1 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育2 h,TBST洗滌3次,每次10 min。用Western印跡熒光檢測試劑盒顯示于X光片。結(jié)果用Labwork凝膠圖像分析系統(tǒng)對膠片掃描,以對照組的面積灰度值為100%與實(shí)驗組進(jìn)行比較和半定量分析。

1.6 膽固醇流出實(shí)驗

檢測方法參照文獻(xiàn)[8],細(xì)胞置于含有10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中共同孵育待細(xì)胞長至85%時,采用PBS液洗滌細(xì)胞,置于含脂蛋白的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。采用PBS液洗滌細(xì)胞,閃爍液裂解細(xì)胞后,用閃爍計數(shù)法檢測培養(yǎng)基和細(xì)胞中的[3H]膽固醇。膽固醇流出率用培養(yǎng)基中CPM除以總CPM(培養(yǎng)基CPM+細(xì)胞CPM),再乘以100%來表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗所得數(shù)據(jù)采用表示。用SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計處理,組間比較采用方差分析及t檢驗,以P＜0.05判定差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 APR小鼠腹腔巨噬細(xì)胞LXRα和ABCA1的表達(dá)情況

分別取對照組和LPS組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,提取總 RNA。RT-PCR檢測 LXRα和 ABCA1 mRNA表達(dá)情況。如圖1所示,與對照組相比,LPS組LXRα和 ABCA1 mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。

圖1 LPS處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞LXRα和ABCA1 mRNA表達(dá)的變化

分別取對照組和LPS組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,提取總蛋白。采用Western印跡分析法檢測細(xì)胞內(nèi)LXRα和ABCA1蛋白質(zhì)含量。如圖2所示,與對照組相比,LPS組LXRα和ABCA1蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。

圖2 LPS處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞LXRα和ABCA1蛋白質(zhì)表達(dá)的變化

2.2 APR小鼠腹腔巨噬細(xì)胞膽固醇流出情況

分別取對照組和LPS組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,用液體閃爍計數(shù)器檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出。如圖3所示,與對照組相比,LPS組細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出減少(P＜0.05)。

圖3 LPS處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞膽固醇流出情況

2.3 LXRα激動劑22(R)-Hch對LPS調(diào)節(jié)ABCA1表達(dá)

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS單獨(dú)處理或LXRα特異性激動劑22(R)-羥基膽固醇(22(R)-Hch)預(yù)處理24 h后聯(lián)合LPS處理,提取細(xì)胞總RNA,采用RT-PCR檢測ABCA1 mRNA表達(dá)。如圖4所示,與LPS組相比,22(R)-Hch與LPS聯(lián)合處理組ABCA1 mRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。

圖4 22(R)-Hch對LPS處理的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞ABCA1mRNA表達(dá)的影響

2.4 LXRα激動劑22(R)-Hch對LPS調(diào)節(jié)膽固醇流出的影響

分別取LPS組和LPS+22(R)-Hch組巨噬細(xì)胞,用液體閃爍計數(shù)器檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出。如圖5所示,與LPS組相比,LPS+22(R)-Hch處理組細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出增加(P＜0.05)。

圖5 22(R)-Hch對LPS處理的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞膽固醇流出的影響

3 討 論

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分。在動物體內(nèi)注射LPS制備APR模型中可觀察到膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)減少[3]。LPS與TLR4結(jié)合后可引起一系列連鎖酶促反應(yīng),引起多種炎癥相關(guān)基因表達(dá)的變化,同時通過增加單核巨噬細(xì)胞的募集和抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的流出促進(jìn)As發(fā)生發(fā)展[9]。ABCA1是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)流出的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,具有減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積的作用[10]。本實(shí)驗采用來源于大腸埃希菌的LPS,采用靜脈注射法制備APR小鼠模型。觀察LPS誘導(dǎo)小鼠APR對ABCA1表達(dá)和膽固醇流出的影響。在本實(shí)驗LPS誘導(dǎo)的APR模型中,LPS抑制ABCA1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。Trasino等[11]最近報道,LPS抑制ABCA1表達(dá),本課題組的實(shí)驗結(jié)果與其結(jié)果相一致,LPS誘導(dǎo)的APR抑制ABCA1表達(dá)。ABCA1具有促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂流出的功能,ABCA1的蛋白質(zhì)表達(dá)減少,不能將細(xì)胞內(nèi)過多的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量脂質(zhì)蓄積,這為LPS加速As斑塊的形成提供了理論依據(jù)。ABCA1的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平受到高度調(diào)控,涉及多種調(diào)控因素,其中促炎細(xì)胞因子,如 TN F-α、I L-1β、C 反應(yīng)蛋白(CRP)和 IFN-γ等在轉(zhuǎn)錄水平通過LXRα下調(diào)ABCA1的表達(dá),LPS、EPA、鈣蛋白酶和鈣調(diào)蛋白等在轉(zhuǎn)錄后水平通過降低A BC A1的穩(wěn)定性促而進(jìn)其降解;主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子是LXRα激動劑、過氧化物酶體增殖物激活型受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)α和PPARγ激動劑[6];其中LXRα在脂質(zhì)代謝途徑中具有重要作用[12-13],與RXR形成LXR/RXR異二聚。研究表明,氧化固醇和反式維甲酸都可以活化此二聚體[14]。LXRs/RXR通過對參與膽固醇脂肪酸代謝的靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié),調(diào)控ABCA1、ABCG1、脂肪酸合成酶(FAS)和膽固醇7α羥化酶等[3],進(jìn)而調(diào)控膽固醇代謝,在脂質(zhì)代謝途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15]。LXRα是ABCA1的上游基因,激活LXRα可以上調(diào)ABCA1的表達(dá)[16-17]。本實(shí)驗結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS處理組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞LXRα表達(dá)顯著降低,與Wang等[18]的結(jié)果相一致,LPS誘導(dǎo)的APR抑制LXRα表達(dá)。因此,推測在APR過程中LPS抑制ABCA1的表達(dá)可能與TLR4/LXRα信號途徑有關(guān)。

本實(shí)驗結(jié)果還顯示,與LPS組相比,22(R)-Hch+LPS處理組ABCA1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加,提示LXRα激動劑22(R)-Hch拮抗LPS對ABCA1的抑制作用,但并不能完全解除對ABCA1的抑制作用。因此推測,LPS除了通過TLR4/LXRα信號途徑外,還存在其他的途徑抑制ABCA1表達(dá)。有研究報道,TLR4/NF-κB信號途徑介導(dǎo)LPS對ABCA1表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的抑制作用[6]。

因此,本研究進(jìn)一步闡明了在LPS誘導(dǎo)的APR小鼠模型中,LPS對ABCA1表達(dá)和膽固醇流出的影響,并探討LXRα在此過程中的作用;在APR反應(yīng)中,通過抑制LPS/TLR4/LXRα信號途徑的激活,可以減輕炎癥,上調(diào)ABCA1的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出,減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積,為As的防治提供新的調(diào)控靶點(diǎn)。在APR過程中,是否還存在與TLR4/LXRα途徑有關(guān)的其他調(diào)節(jié)ABCA1表達(dá)機(jī)制,還有待于進(jìn)一步探討。

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