王柏琦,陳艷華,蔣麗琴,程愛蘭

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,湖南衡陽421001;2.南華大學(xué)腫瘤研究所)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)是我國南方地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一,EB病毒感染、遺傳因素、營養(yǎng)狀況、年齡等均與本病的發(fā)生存在一定關(guān)聯(lián)[1],但其發(fā)病機(jī)制目前仍不明了。近年來,DNA甲基化等表觀遺傳學(xué)的改變在腫瘤中的作用日益受到重視[2]。生理?xiàng)l件下,DNA甲基化是維持DNA穩(wěn)定性以及DNA與蛋白質(zhì)相互作用所必須[3]。然而DNA異常甲基化也可導(dǎo)致多種癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活。其中最常見的抑癌基因包括回復(fù)引導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白含kazal基元(Reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs,RECK)、Ras相關(guān)區(qū)域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)等,這些抑癌基因的失活與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)[4]。近年來研究顯示,RECK蛋白可抑制機(jī)體基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)的水解從而抑制腫瘤細(xì)胞血管發(fā)生與轉(zhuǎn)移[4]。

姜黃素是一種二酮類化合物,目前已經(jīng)研究顯示姜黃素對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[5]。但迄今為止,姜黃素能否影響鼻咽癌細(xì)胞中RECK基因的甲基化,目前仍不清楚。本研究擬從姜黃素入手,觀察食源性物質(zhì)能否影響鼻咽癌CNE-1細(xì)胞系中RECK基因的表達(dá)和甲基化,并觀察其是否能影響MMP-9的活性而發(fā)揮抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料

姜黃素(純度98%)為sigma產(chǎn)品。DNA提取試劑盒購自Qiagen,核蛋白提取試劑盒購自Pierce?？筂MP-9多克隆抗體購自Santa Cruz,HPR標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物有限公司。EpiQuik DNMT活性檢測試劑盒購自Epigentek公司。其他分析純產(chǎn)品主要購自上海生工生物工程公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與MTT實(shí)驗(yàn)

CNE-1鼻咽癌細(xì)胞系購于ATCC,用含有10%FBS和1%青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。MTT法檢測細(xì)胞的增殖活性。即100 μL細(xì)胞(約3×103)接種于96孔板中培養(yǎng)過夜,每組設(shè)3復(fù)孔。第二天換成含5% 胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基,并加入不同濃度的姜黃素,繼續(xù)培養(yǎng)72 h。結(jié)束前4 h各孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL),隨后棄上清,并加入 200 μL DMSO,充分混勻,用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度值(OD570),并計(jì)算抑制率。抑制率=(對照組OD值-實(shí)驗(yàn)室OD值)/對照組OD值×100%。

1.3 Western blot與甲基化活性分析

細(xì)胞處理完畢后,800 rpm離心5 min,棄上清,冰冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次。加入200 μL細(xì)胞裂解緩沖液重懸浮細(xì)胞(裂解液含蛋白酶抑制劑cocktail SetⅢ,1mM β-甘油磷酸酯、1 mmol/L 釩酸鈉、1 mmol/L氟化鈉,1 mmol/L苯甲磺酰基氟化物,20 mmol/L pH 7.0 HEPES、150 mmol/L NaCl,0.1%NP-40),冰上裂解40 min。1 000 rpm離心15 min后,獲取上清。經(jīng)5% ～15%SDS-PAGE后,Western blot檢測 RECK或 MMP-9的表達(dá)。同時(shí)采用EpiQuikTMDNMT試劑盒檢測CNE-1細(xì)胞核蛋白中的甲基化活性。

1.4 DNA提取和水解

獲取1×107個(gè)姜黃素處理后的CNE-1細(xì)胞,按照Qiagen提供的試劑盒操作步驟提取基因組DNA用于全細(xì)胞甲基化分析。DNA根據(jù)參考文獻(xiàn)提供的方法進(jìn)行[6],即200 ng基因組DNA于100℃、3 min熱處理變性,置于冰上冷卻后加入1/10體積的醋酸銨(0.1 mol/L,pH 5.3)和2 U的核酸酶P1(Sigma),45℃孵育2 h后加入1/10體積的NH4HCO3(濃度1 mol/L)和0.002 U的毒液磷酸二酯酶I,37℃孵育1 h。隨后加入0.5 U堿性磷酸酶,37℃培養(yǎng)1 h。

1.5 高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜檢測DNA甲基化

液相色譜包括HPLC系統(tǒng)(Agilent 1100型),色譜柱(Atlantis dC18柱,Waters),預(yù)柱(Waters)。流動(dòng)相為0.1%甲酸-甲醇,流速為0.2 mL/min。電噴霧離子模式為正離子,掃描范圍為m/z 100～2 000,離子源溫度450℃,噴霧電壓為415 kV,破簇電壓為55 V,入口電壓6V。碰撞能電壓13 V,氣簾氣為138 kPa,氣體1為221 kPa,氣體2為379 kPa,碰撞氣體為41 kPa[6]。采用Sciex Analyst software軟件(版本1.3.1)處理數(shù)據(jù)。

1.6 Real-Time PCR分析

采用定量RT-PCR檢測RECK和MMP-9的表達(dá)。細(xì)胞處理完畢,用Trizol試劑提取總RNA,取2 μg RNA用于 MMP-9 mRNA分析。反應(yīng)條件:50℃2 min,95℃3 min,然后95℃15 s,60℃30 s,72℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在ABI prism 7700上進(jìn)行。所得的數(shù)據(jù)與內(nèi)參β-acin之比作為相對值。

1.7 明膠酶譜實(shí)驗(yàn)

姜黃素處理細(xì)胞后,獲取25 μL培養(yǎng)上清用于聚丙烯酰胺凝膠電泳(含2 mg/mL明膠A和明膠B)。電泳結(jié)束后,卸下凝膠并將其置于Triton X-100(2.5%)的洗滌液中震蕩洗滌以去除SDS。隨后將凝膠放入100 mL孵育液中(100 mmol/L Tris,10 mmol/L CaCl2),37℃中孵育24 h,經(jīng)0.5%考馬斯亮藍(lán)染色并脫色后,用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素增加CNE-1細(xì)胞RECK mRNA和蛋白表達(dá)

如圖1所示,CNE-1細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下RECK蛋白表達(dá)水平較低,而經(jīng)10 μmol/L和30 μmol/L姜黃素處理后,細(xì)胞內(nèi)RECK蛋白的表達(dá)顯著增高(圖1A)。與Western blot結(jié)果類似,real-time PCR結(jié)果顯示,不同濃度的姜黃素也能增強(qiáng)其mRNA的表達(dá),其趨勢與蛋白表達(dá)一致(圖1B)。

圖1 姜黃素增加CNE-1細(xì)胞RECK蛋白和mRNA表達(dá)

2.2 姜黃素能降低RECK啟動(dòng)子區(qū)域以及全基因組以及細(xì)胞核DNA甲基化

高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜結(jié)果顯示,30 μmol/L姜黃素處理CNE-1細(xì)胞后,與對照組相比,RECK啟動(dòng)子甲基化水平降低為(69.04±10.62)%,全基因組甲基化水平降低為(61.13±7.08)%,CNE-1細(xì)胞核的甲基化活性降為2.8±1.31,見表 1。

表1 姜黃素對RECK啟動(dòng)子區(qū)域、全基因組以及細(xì)核DNA甲基化的影響

2.3 姜黃素能下調(diào)CNE-1細(xì)胞MMP-9的表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示,CNE-1細(xì)胞 MMP-9表達(dá)水平較高,1、10、30 μmol/L姜黃素處理細(xì)胞后,MMP-9蛋白水平顯著降低(圖2A)。Real-time PCR結(jié)果也顯示其mRNA也隨著姜黃素濃度的增高而逐漸降低(圖2B)。

圖2 姜黃素抑制CNE-1細(xì)胞MMP-9蛋白和mRNA表達(dá)

2.4 姜黃素對鼻咽癌細(xì)胞增殖及MMP-9酶活性的影響

CNE-1細(xì)胞在濃度為10、30 μmol/L姜黃素作用下的存活率分別為44%和23%。此外,明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示,姜黃素也能顯著抑制其酶活性,隨著姜黃素濃度的增高,酶活性逐漸降低(圖3)。

3 討 論

圖3 姜黃素對鼻咽癌細(xì)胞增殖及MMP-9酶活性的影響

腫瘤從原發(fā)部位脫落并引起細(xì)胞外基質(zhì)降解,是轉(zhuǎn)移發(fā)生的關(guān)鍵步驟。在此過程中,MMPs發(fā)揮至關(guān)重要作用,其中以MMP-9最為重要[4,7]。RECK是調(diào)控MMP-9蛋白表達(dá)與活性的重要分子[8]。正常情況下,RECK基因廣泛存在于機(jī)體各種組織細(xì)胞中,調(diào)控細(xì)胞的生長增殖等功能。但在各種惡性腫瘤細(xì)胞中,RECK蛋白往往呈低表達(dá),且其基因中存在異常的甲基化,從而導(dǎo)致其功能減弱或消失,最終無法發(fā)揮對MMP-9的負(fù)調(diào)控作用而參與腫瘤的發(fā)生[9-10]。本研究證實(shí),CNE-1細(xì)胞內(nèi)RECK的mRNA和蛋白水平較低。經(jīng)1～30 μmol/L姜黃素處理后,RECK基因mRNA和蛋白水平隨姜黃素濃度的升高而增加。這表明姜黃素能有效上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞中因甲基化而失活的RECK基因的表達(dá)。此外,CNE-1細(xì)胞中啟動(dòng)子、全基因組以及細(xì)胞核中甲基化RECK含量較高,而姜黃素處理后,甲基化水平顯著降低。由于RECK基因甲基化后導(dǎo)致其對MMP-9的負(fù)調(diào)控功能減弱或消失,從而有利于腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落并轉(zhuǎn)移。姜黃素通過抑制其啟動(dòng)子區(qū)域甲基化,從而誘導(dǎo)RECK基因表達(dá)而重新獲得對MMP-9的調(diào)控作用,這可能是其抗癌活性的一種新的分子機(jī)制[11]。

Western blot結(jié)果也證實(shí),姜黃素能抑制CNE-1細(xì)胞中MMP-9的表達(dá),并能在一定程度上降低其酶活性。鑒于MMP-9基因上游存在RECK的調(diào)控位點(diǎn),因此姜黃素對MMP-9的抑制可能與上調(diào)RECK基因的表達(dá)有關(guān)。由于MMP-9是腫瘤細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要分子,其表達(dá)水平和酶活性受到抑制后,無疑能降低腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力[12]。

有研究顯示,使用姜黃素處理鼻咽癌細(xì)胞后,能導(dǎo)致E-鈣粘蛋白表達(dá)增高以及促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,這與DNA甲基化酶抑制劑相似[13-14]。也有研究顯示某些因超甲基化而沉默的抑癌基因,如GSTP1和MGMT,也能被姜黃素等去甲基化藥物誘導(dǎo)而重新激活[15],這也從側(cè)面證明了姜黃素對DNA甲基化具有抑制作用,并能重新激活失活的抑癌基因。目前,DNA去甲基化藥物(如氮胞苷類藥物)已經(jīng)在臨床上用于各種血液系統(tǒng)疾病的治療并取得了一定的療效[16-17]。由于姜黃素對DNA甲基化具有一定的抑制作用,因此有望為鼻咽癌的治療提供一種新的輔助手段。姜黃素來源于天然植物,其毒性低[18]。此外,對于此氮胞苷類藥物治療無效的細(xì)胞,如干細(xì)胞,姜黃素可能具有更加廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

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