何鐵光等

摘 要：用辣椒耐熱自交系A(chǔ)11和熱敏自交系B22配置雜交組合，通過高溫脅迫處理鑒定其F2代分離群體的耐熱性。從123對(duì)Taq I/Ase I引物組合中篩選出6對(duì)多態(tài)性好的引物對(duì)F2代耐熱、熱敏植株進(jìn)行AFLP分析，共擴(kuò)增出約11 400條清晰條帶，其中2條為穩(wěn)定的差異，初步獲得了2個(gè)與辣椒耐熱性狀相關(guān)的AFLP分子標(biāo)記。研究有助于開展辣椒耐熱基因的分子標(biāo)記輔助選擇工作，提高辣椒育種效率和水平，并為分離和克隆辣椒耐熱相關(guān)功能基因奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：辣椒；耐熱基因；AFLP分析

中圖分類號(hào)：Q785；S641.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-3547（2014）04-0024-03

辣椒（Capsicum annuum L.）原產(chǎn)于中南美洲，屬于茄科（Solanaceac）辣椒屬（Capsicum）。辣椒是重要蔬菜作物，在世界各地廣泛栽培，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、富含維生素C等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而深受人們喜愛[1]。我國(guó)是世界辣椒種植面積最大的國(guó)家，國(guó)內(nèi)的種植面積僅次于大白菜，屬于第二大蔬菜作物。近年來(lái)，辣椒在華南地區(qū)也有了較大的種植面積，但廣西、海南等省份地處熱帶、亞熱帶地區(qū)，四季高溫多雨，對(duì)辣椒的生長(zhǎng)發(fā)育造成了極大的影響，當(dāng)氣溫高于35℃時(shí)，辣椒開花及結(jié)實(shí)均受到了明顯的影響，大大降低了辣椒的品質(zhì)和產(chǎn)量。近10多a來(lái)，已有不少學(xué)者對(duì)高溫脅迫下辣椒的植株形態(tài)、生理生化指標(biāo)進(jìn)行了研究，但從分子水平系統(tǒng)研究辣椒耐熱特性的報(bào)道較少[2～6]。本研究以辣椒耐熱高代自交系A(chǔ)11與辣椒熱敏高代自交系B22雜交的F2代植株為材料，進(jìn)行了耐高溫脅迫后，選擇耐熱和熱敏的植株進(jìn)行AFLP分析，尋找與辣椒耐熱性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，為辣椒耐熱相關(guān)功能基因的克隆分析及進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料為辣椒耐熱高代自交系A(chǔ)11與辣椒熱敏高代自交系B22雜交的F2代植株，采用大棚栽培和人工氣候箱盆栽方式種植。試驗(yàn)所需生化試劑、酶類購(gòu)自南寧宏泰、Fermentas公司及New Englad公司。AFLP分析所用接頭和引物由捷瑞公司合成，相關(guān)信息如下。

Ase I 接頭序列：5'-TAGGTACGCAGTCTAC-3'； 5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'；Ase I 預(yù)擴(kuò)增引物序列：5'-CTCGTAGACTGCGTACCTAAT-3'；Ase I 選擇性擴(kuò)增引物序列：5'-GACTGCGTACCTAATNNN-3'， N 為A、T、C、G 堿基的任意一種。Taq I 接頭序列：5'-GACGATGAGTCCTGAC-3'；5'-CGGTCAGGACTCAT-3'；Taq I 預(yù)擴(kuò)增引物序列：5'-GACGATGAGTCCTGACCGA-3'；Taq I 選擇性擴(kuò)增引物序列：5'-GATGAGTCCTGACCGANNN-3'，N 為A、T、C、G 堿基的任意一種。

1.2 辣椒葉片總DNA的提取及酶切反應(yīng)

利用改良SDS法小量提取F2代耐熱及熱敏辣椒植株葉片的總DNA，對(duì)所提取的總DNA分別進(jìn)行抽提純化和電泳檢測(cè)。

利用限制性內(nèi)切酶Taq I和Ase I對(duì)總DNA進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物回收純化后備用。

1.3 接頭退火及連接反應(yīng)

Ase I接頭和Taq I接頭退火，然后與DNA雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物保存于

-20℃冰箱備用。

1.4 AFLP 分析

①預(yù)擴(kuò)增反應(yīng) 分別以所有樣品的連接產(chǎn)物為模板，用與Taq I接頭、Ase I接頭匹配的預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序是94℃ 5 min、94℃ 80 s、52℃ 60 s、72℃ 90 s，20個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物按需要進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋備用。

②選擇性擴(kuò)增 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物分別稀釋成5倍、10倍、15倍和20倍的工作用液，篩選合適的擴(kuò)增模板濃度。利用選擇性擴(kuò)增引物對(duì)A11、B22雜交F2代辣椒植株進(jìn)行AFLP分析，94℃ 3 min；94℃ 80 s，65℃ 60 s，72℃ 90 s，每循環(huán)退火溫度下降0.7℃，反應(yīng)12個(gè)循環(huán)；然后94℃ 3 min；94℃ 80 s，56℃ 60 s，72℃ 90 s，23個(gè)循環(huán)；延伸72℃ 10 min。

③電泳檢測(cè) 配制6%丙烯酰胺變性凝膠，電泳及銀染參照王關(guān)林等[7]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒葉片總DNA的提取

用SDS法從辣椒葉片中提取的總DNA的OD260/OD280比值在1.8左右，在1%的瓊脂糖凝膠中樣品帶清楚、凝膠背景清晰（圖1），經(jīng)過RNase A處理和酚/氯仿抽提后適用于酶切、連接等試驗(yàn)。

2.2 AFLP反應(yīng)體系的建立

在預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)中，進(jìn)行濃度測(cè)定，根據(jù)濃度的大小稀釋10～20倍后用作AFLP預(yù)擴(kuò)增的模板，進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增條件優(yōu)化研究。結(jié)果表明，以連接產(chǎn)物的10倍稀釋液為模板，擴(kuò)增20循環(huán)的效果最好，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物主要集中在100～750 bp（圖2）。

選擇性擴(kuò)增以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋15倍為模板，擴(kuò)增約35個(gè)循環(huán)效果較好（包括降落PCR部分）。循環(huán)數(shù)少，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物濃度低，在變性聚丙烯酰胺凝膠中條帶顏色較淺，通過延長(zhǎng)顯色時(shí)間可以增加條帶的清晰度，但是也導(dǎo)致了凝膠背景增加；循環(huán)數(shù)過多時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度過高和非特異條帶增多，變性凝膠中模糊的弱條帶增多，重復(fù)效果不穩(wěn)定。

2.3 辣椒耐熱基因的AFLP分析

本研究利用123對(duì)引物組合對(duì)辣椒耐熱、熱敏基因池進(jìn)行了引物篩選，從中選擇6對(duì)多態(tài)性較好的引物組合對(duì)辣椒F2代植株進(jìn)行AFLP分析。聚丙烯酰胺變性凝膠電泳結(jié)果顯示，每個(gè)樣品的擴(kuò)增條帶多數(shù)在30～70條，獲得11 400條穩(wěn)定、清晰條帶。其中A8T19和A12T15引物組合的擴(kuò)增結(jié)果中，耐熱辣椒品種中分別出現(xiàn)1條穩(wěn)定的差異條帶，推斷該差異條帶與辣椒耐熱性狀相關(guān)，至于確切關(guān)系還有待進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

3 討論與結(jié)論

AFLP分析多態(tài)性豐富、靈敏度高、重復(fù)性好[8，9]，在植物分子標(biāo)記研究中應(yīng)用廣泛，但DNA模板的質(zhì)量高低及銀染操作水平均對(duì)其分析結(jié)果產(chǎn)生重要影響，尤其在銀染中無(wú)水碳酸鈉（Na2CO3）質(zhì)量、漂洗操作及顯色時(shí)間的控制對(duì)條帶的清晰度和凝膠的背景的影響尤為突出[10]。

辣椒材料的高溫脅迫試驗(yàn)結(jié)果的判定對(duì)利用AFLP技術(shù)分析辣椒耐熱性狀相關(guān)基因的結(jié)果有十分重要的影響。本研究的高溫脅迫試驗(yàn)中，在42℃、相對(duì)濕度75%的條件下保持一定時(shí)間后，根據(jù)辣椒植株的形態(tài)特征去判定F2代植株的耐熱性，主觀的判定標(biāo)準(zhǔn)會(huì)對(duì)AFLP分析結(jié)果產(chǎn)生影響；如能結(jié)合分析高溫脅迫下辣椒的生理生化指標(biāo)，可以提高判定F2代植株的耐熱、熱敏性的準(zhǔn)確性[11]。在AFLP分析中耐熱、熱敏辣椒材料之間的差異條帶是否與耐熱性狀相關(guān)或連鎖還需要進(jìn)一步的回收克隆及進(jìn)行功能分析來(lái)加以確定。

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